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膀胱癌作为泌尿系肿瘤中最为常见的恶性肿瘤之一,目前膀胱癌的推荐性治疗,包括从经尿道切除,根治性膀胱全切术到综合性放化疗,仅仅对部分患者有效。深入研究膀胱癌的发病机制,寻找其内在发病分子靶点和相关激活的分子通路是发现新的膀胱癌诊断和治疗方法必不可少的。越来越多的研究发现,长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)在多种肿瘤的形成和进展中起到至关重要的作用。既往的研究表明长链非编码RNA SPRY4-IT1在多种肿瘤中高表达,并且其上调往往预示着较差的临床预后和更快的肿瘤进展。但是其在膀胱癌的作用机制尚不清楚。因此,本研究旨在研究SPRY4-IT1在人体膀胱癌组织的表达情况及与临床相关指标的联系,揭示其在膀胱癌的诊断和治疗中的潜在意义;通过体外实验,探索SPRY4-IT1对膀胱癌细胞系的生物学行为的影响,并研究其具体的作用机制;并通过体内实验进一步验证其作用机制。本研究主要分为以下三个部分:第一部分SPRY4-IT1在人膀胱癌组织标本及细胞系中表达及其对膀胱癌细胞系生物学行为的影响实验目的:检测人膀胱癌组织与癌旁正常组织以及正常尿路上皮细胞系(SV-HUC-1)和膀胱癌细胞系中SPRY4-IT1的表达差异,揭示其与临床相关指标的关系。并确定其对膀胱癌细胞系生物学行为的影响。实验方法:采用实时定量荧光PCR(qRT-PCR)法分别检测60例膀胱癌临床组织标本及细胞系中SPRY4-IT1的表达水平,分析其表达差异。并采用统计学方法分析其表达差异与临床相关指标的关系。采用shRNA敲低SPRY4-IT1,研究其对膀胱癌细胞的凋亡,增殖以及侵袭迁移功能的影响。实验结果:和正常膀胱组织相比,SPRY4-IT1基因的mRNA在75.0%的(45/60)的膀胱癌组织中的表达显著上调。相较SV-HUC-1细胞,EJ,T24T以及UMUC3细胞中的SPRY4-IT1表达均显著上调。并且t检验分析表明,SPRY4-IT1的上调与肿瘤更高的临床恶性分级以及更多的淋巴结转移和远处转移相关。体外基因敲低实验显示下调SPRY4-IT1可以显著促进膀胱癌细胞的凋亡,膀胱癌细胞增殖和其侵袭迁移能力也明显下降。实验结论:在膀胱癌中,SPRY4-IT1基因起促癌作用,其高表达预示更差的临床预后。其在膀胱癌组织标本和膀胱癌细胞系中均呈高表达,并且其表达下调后可以显著促进膀胱癌细胞的凋亡,抑制其细胞增殖、侵袭迁移的能力。第二部分 SPRY4-IT1对膀胱癌细胞系生物学行为影响的作用机制研究实验目的:探索SPRY4-IT1促进膀胱癌细胞的增殖和转移能力的内在作用机制,揭示其具体作用通路。实验方法:采用生物信息数据库,分析其与SPRY4-ITI可能直接作用的miRNAs,并采用RNA pulldown实验进一步验证,找到于其直接作用的miRNA。采用qRT-PCR及Western Blot法检测膀胱在细胞系T24T及UMUC3中SPRY4-IT1对miRNA以及下游相关信号通路基因的mRNA、蛋白质的表达的影响,找到具体的作用通路。构建含有EZH2基因启动子和含有和miR-101-3p结合位点的3’-UTR野生型双荧光素酶报告载体,采用双荧光素酶法进一步验证SPRY4-IT1对EZH2的调控作用方式。并设计分步“逆转”实验进一步验证SPRY4-IT1对miRNA的分子海绵的作用及下游的具体调控通路。实验结果:RNA pulldown实验表明SPRY4-IT1可以与miR-101-3p特异性直接结合并起到作为miR-101-3p分子海绵的作用。并且下调SPRY4-ITI后,miR-101-3p以及E-cadherin蛋白表达上调,EZH2的mRNA及蛋白显著下调。双荧光素酶实验证明SPRY4-IT1对EZH2的启动子活性无影响,而影响EZH2 3’-UTR双荧光素酶活性。在“逆转”实验中,转入anti-miR-101-3p可以逆转T24T和UMUC3细胞系中下调SPRY4-IT1所导致的细胞生物学行为的变化和下游的EZH2蛋白的表达。实验结论:SPRY4-IT1可作为miR-101-3p分子海绵,下调mmiR-101-3p的表达,并通过miR-101-3p介导的转录后调控上调EZH2的表达,从而促进膀胱癌增殖和转移,加速膀胱癌的进展。第三部分SPRY4-IT1对膀胱癌细胞裸鼠体内生长的影响实验目的:进一步体内活体实验验证SPRY4-IT1对膀胱癌细胞生物学行为的影响,并进一步验证 SPRY4-IT1/miR-101-3p/EZH2/E-cadherin 调控轴的调控通路。实验方法:构建裸鼠的皮下瘤以及尾静脉肺转移模型,皮下或者尾静脉注射稳定表达的sh-NC或者shSPRY4-IT1的T24T细胞。皮下瘤组记录皮下肿瘤的体积,24日后处死裸鼠并且获得皮下瘤标本,行免疫组化,提取RNA及蛋白行qRT-PCR及Western Blot检测miR-101-3p,EZH2及E-cadherin的含量。尾静脉模型组60日后获得小鼠肺组织,计数其表面转移结节数,并行HE染色分析。实验结果:皮下瘤实验组结果表明,shSPRY4-IT1组与sh-NC组相比,小鼠的肿瘤体积明显较小,并且其肿瘤标本中miR-101-3p的mRNA与E-cadherin的蛋白含量显著上调,而EZH2的蛋白含量显著下调。尾静脉实验组表明SPRY4-IT1敲低组其肺转移病灶明显较对照组少。实验结论:下调SPRY4-IT1在活体实验中可以明显抑制膀胱癌的生长和转移,并且为针对SPRY4-IT1的膀胱癌靶向治疗提供了新的证据