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目的:RNA依赖的ATP水解酶DHX16属于DEXD/H-box解旋酶家族,在人前体mRNA(pre-mRNA)剪接过程中,催化ATP,促进剪接体复合物B向复合物C转化,为人pre-mRNA剪接过程所必需。研究发现,DEXD/H-box解旋酶水解ATP的功能常依赖相互作用蛋白的刺激与调控。在人类细胞中,是否也存在DHX16的作用蛋白,能够调控DHX16蛋白的ATP水解功能,至今尚不清楚。课题组前期以剪接因子DHX16为诱饵蛋白,应用酵母双杂交技术,成功捕获了GPKOW蛋白。在前期的研究基础上,本研究旨在检测GPKOW与RNA结合及与DHX16蛋白相互作用的特点,鉴定GPKOW蛋白是否为人类剪接体新成员,为人pre-mRNA剪接过程所必需,并在实验结果上,探讨GPKOW与DHX16蛋白相互作用在人pre-mRNA剪接过程中可能的作用机制。方法:利用基因工程技术克隆GPKOW基因,并构建GPKOW的截断突变体和点突变体;在大肠杆菌DE3pLysS系统以IPTG诱导表达His6-GPKOW融合蛋白,结合钴亲和树脂和poly(U)琼脂糖珠亲和层析法纯化His6-GPKOW融合蛋白;应用Northwestern和EMSA检测GPKOW蛋白与RNA结合;通过pull down和免疫共沉淀方法检测GPKOW与DHX16体外相互结合,并以体内剪接分析方法检测GPKOW在剪接过程中调控DHX16功能;提取HeLaS3细胞核,通过体外剪接分析方法鉴定GPKOW蛋白为人剪接体新成员,以及体外剪接体复合物分析方法确定GPKOW蛋白在剪接过程发挥作用的关键阶段。结果:1.人GPKOW蛋白与不同物种包括牛蛙(Q6NU07)、斑马鱼(Q90X38)及小鼠(Q56A08)的GPKOW同系物进行比对发现,GPKOW蛋白在G-patch、KOW1及KOW2结构域上有高度的保守性;2.经酶切分析和测序结果显示,成功构建重组质粒pET28a(+)/His6-GPKOW和pEGFP-C1-GPKOW;重组质粒pET28a(+)/His6-GPKOW-△N,-△C,-△M及-△N C截断突变体;pET28a(+)/His6-GW和-GK点突变体及pEGFP-C1-GW和-GK点突变体;3.结合钴柱和poly(U)琼脂糖珠亲和层析法纯化His6-GPKOW融合蛋白,经15%SDS-PAGE凝胶分离,考马斯亮蓝染色,结果可见蛋白纯度高,未见明显背景蛋白;4.分离HeLa细胞核及细胞质蛋白成分,通过Western blotting鉴定GPKOW属于细胞核成分;荧光显微镜观察GFP-GPKOW定位于细胞核,呈弥漫分布;5. Northwestern和EMSA方法确定GPKOW与体外转录合成的U2,U4,U5,U6snRNA及pre-mRNA pRG1结合,KOW1结构域突变影响GPKOW-RNA结合;6. Pull down和免疫共沉淀结果显示GPKOW与DHX16蛋白体外相互结合,G-patch结构域突变导致GPKOW丧失与DHX16结合的能力,且RNA酶A消化细胞提取物的RNA后不影响GPKOW与DHX16体外相互结合,GPKOW与DHX16蛋白在正常生理盐浓度下相互结合,但NaCl盐浓度升高到0.3M和0.5M,可破坏GPKOW与DHX16蛋白相互结合;7.体内剪接分析显示GPKOW能改善DHX16优势突变体引起的pre-mRNA剪接缺陷,但不能改善呢亚霉素(MMS)引起的pre-mRNA剪接缺陷,GPKOW调控DHX16蛋白功能是特异的;8. GPKOW野生型和G-patch结构域点突变体GPKOW-GW可以部分改善DHX16优势突变体引起的pre-mRNA剪接缺陷,而KOW1结构域点突变体GPKOW-GK失去抑制DHX16优势突变体引起的pre-mRNA剪接缺陷的功能;9.应用纯化的His6-GPKOW融合蛋白作为抗原,皮下注射抗原免疫刺激新西兰雌兔,获得抗全长GPKOW抗体血清;10. Anti-GPKOW抗体可以免疫共沉淀pre-mRNA、中间剪接产物,U1、U2和U6snRNA;11.应用抗全长GPKOW抗体血清免疫共沉淀法去除HeLaS3NE中的GPKOW蛋白,导致pre-mRNA剪接缺陷,同时引起剪接体复合物Bact聚集;12.纯化的GPKOW野生型和G-patch结构域点突变体GPKOW-GW回补到去除GPKOW蛋白的HeLaS3NE中,能够恢复剪接功能,但相同量的KOW1结构域点突变体GPKOW-GK只能相对地部分恢复剪接功能。结论:1.成功构建重组质粒pET28a(+)/His6-GPKOW和pEGFP-C1-GPKOW;2.成功构建重组质粒pET28a(+)/His6-GPKOW-△N,-△C,-△M及-△NC截断突变体;pET28a(+)/His6-GK和-GW点突变体;pEGFP-C1-GK和-GW点突变体。3.结合钴柱和poly(U)琼脂糖珠亲和层析纯化法获得高纯度的His6-GPKOW融合蛋白;4. GPKOW定位于细胞核,为RNA结合蛋白,通过KOW1结构域与RNA结合;5. GPKOW通过G-patch结构域与DHX16蛋白在体外相互结合,这种结合不依赖RNA,且具有盐浓度敏感性;6. GPKOW蛋白在剪接反应中与pre-mRNA、剪接产物及snRNAs相联系;7. GPKOW是人类剪接蛋白及为人pre-mRNA剪接过程所必需;8. GPKOW蛋白在剪接体复合物Bact转变成剪接体复合物C的过程发挥功能;9. GPKOW在pre-mRNA剪接过程,通过KOW1结构域调控DHX16蛋白功能。