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CRISPR/Cas9技术是一种新型的基因组靶向修饰技术,可以对生物体基因组特异位点进行定点改造。能够高效的在靶位点产生DNA双链缺口(Double-strand breaks,DSB)。通过有错误倾向的非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)机制修复,从而引入插入缺失突变。肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)是一类能够在骨骼肌中特异表达,并对骨骼肌的生长起到负调控作用的糖蛋白,又被称为生长分化因子-8(Growth differentiation factor-8,GDF-8),属于转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族。MSTN基因的缺失或突变可引起动物出现“双肌”性状,促进动物肌肉的生长,提高产肉性能。利用CRISPR/Cas9技术制备MSTN基因敲除的绵羊肌卫星细胞,为制备MSTN基因敲除绵羊个体提供了材料。试验设计了4组特异靶向绵羊MSTN基因的靶位点,通过酶切连接的方法插入到CRISPR/Cas9骨架载体中并对其测序验证。通过酶消化法,分离培养了绵羊肌肉卫星细胞,在形态学和分子生物学的角度对其进行验证,并对其脂质体转染条件进行优化。将构建的载体转染到细胞内,通过一代测序和SURVEYOR分析对载体的有效性和敲除效率进行检测。运用极限稀释的方法挑选基因稳定敲除的细胞克隆,再通过TA克隆的方法确定基因突变类型,并对突变后的基因序列进行初步的生物信息学分析。成功构建了4个能够靶向MSTN基因的特定位点的CRISPR/Cas9打靶载体。细胞诱导分化结果表明分离培养的细胞具有融合形成肌管的能力;RT-PCR结果表明肌卫星细胞的特异表达基因MyoG、MyoD、Myf5等在细胞中均有表达,说明分离的细胞确为肌卫星细胞。按照最优转染条件细胞转染后,测序结果显示pX330-target1和pX330-target4载体作用的靶位点处出现突变,SURVEYOR分析检测其在靶位点产生突变的效率分别为24.20%和10.18%。通过极限稀释法,共获得12个MSTN基因突变的细胞克隆,其中一株为纯合突变。序列比对发现突变基因靶位点处一般有小片段碱基插入或缺失突变,部分会出现移码突变。生物信息学分析表明:突变后的MSTN基因已经失去了原有的生物活性,该基因已被成功敲除。成功利用CRISPR/Cas9系统实现了对绵羊MSTN基因的特异敲除,证明该系统可有效应用于绵羊的基因组编辑,获得的具有稳定突变的细胞克隆和构建的CRISPR打靶载体为后续制备MSTN基因敲除绵羊个体提供了材料。