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丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)的全基因组序列测定,曾经由于许多方面的条件限制而难于完成。但是,其对于研究HCV分子病毒学、流行病学、进化和致病性却至关重要,特别是在临床应用中,不同序列的基因型决定α-干扰素治疗的不同效果。在本研究完成之前,HCV基因型6仅有6个亚型有其全基因组序列。因此,本研究的主要目的在于,测定HCV变异株代表基因型6其余的11个亚型和新亚型的全基因组序列,并深入分析。
本研究从样品分别来自于中国、泰国,和在美国及加拿大生活的东南亚国家移民的HCV感染者。因为样品有限,改良传统的PCR方法,摸索出“桥”和“岛”DNA全序列扩增法,从每例样品100μl血清或从100μl血清中获得的cDNA中测定了13个HCV全基因组核苷酸序列。
以来源于Genbank的已知基因型6的七个全长序列为参考对所测定的13个亚型全序列进行共同分析显示,这些全基因组核苷酸的两两比较相似率变化范围为71.9%--82.7%,著地,这四对序列间的相同率高于标准定义的HCV基因亚型之间的范围值75%-80%。为了进一步理解和证实这些亚型间的遗传相似性,本研究还测定了代表这4对亚型的病毒原型株的全基因序列,结果显示了相同的核苷酸水平上的变异范围,这为HCV基因亚型的分类提供了新的认识,亦强调了全长序列对于分类的重要性。
从系统发育方面的分析证实,本研究所测得的13个分离株都属于基因型6。在系统发育树上,每个病毒株代表一个独立的枝。并形成了高度分化的HCV基因型6分枝,从而清楚显示,各亚型的独立分布。本研究至此完成了基因型6中17个亚型的全序列测定,而km41和gz52557因缺乏其临床上和流行病学上的多个感染病例的证实,而继续保留其亚型未命名状态。结合来源于Los Alamos HCV database的基因型6的已知部分序列的变异株进一步分析,发现各相近亚型变异株均来自东南亚或东南亚国家移民,这提示了这些HCV的相同感染源。
为了探讨HCV夫妻间传播的可能性,本研究还测定了来自于泰国的两位感染HCV的献血员及其感染HCV的配偶。这4个基因序列C-0044和C-0046之间核苷酸相同率为98.1%,而C-0185和C-0192之间为97.8%。文献研究感染HCV的夫妇间的部分亚基因序列的相同率为96.3%至100%,本研究结果与此范围相符,并第一次用全基因组序列提示了HCV在夫妻间传播的可能性。
本研究还测定了基因型6的另一个变异株的全基因组序列:HK6554,香港的某患者,与上文中的GX004一起,均为静脉吸毒者,并共同感染了HCV和HIV-1。分析结果还表明了一种趋势,即是在中国南方,基因亚型6e有从以前的地方性传播方式转为现有的流行性传播方式。这种转变可能由于静脉吸毒感染HCV的人群的网络传播而加快。
综上,本研究用传统PCR、简并引物结合链特异引物的方法有效地测定了共21个病毒株的全基因序列。该方法也可用于其它分子流行病学的研究,特别在测定珍贵的病毒序列然而样品量又受限时。本研究所测定的全基因组序列代表HCV中最古老、分化最多、地方性传播、又可能动物源性的基因型6的全套17个亚型。这有助于进一步理解HCV基因亚型的分类意义、更准确评价HCV的进化和起源,亦有助于发现HCV新的变异株和提高临床诊断、治疗,为将来HCV的流行及公众健康的预测、预防和疫苗的制备奠定了坚实的分子遗传学基础。