禽流感(AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病。自1878年意大利首先发现至今,世界各地都有特定毒株引起的禽流感爆发和流行。目前,高致病性禽流感(HPAI)已被国际兽疫局规定为A类动物传染病。近年来,禽流感在我国开始流行,特别是2003-2004年初高致病性禽流感在我国和部分亚洲国家爆发流行,不仅造成了养禽业的巨大经济损失,而且导致人类的感染和死亡,引起了世界各国政府和普通民众的高度重视。其防制已直接关系到养禽业的持续稳定发展和人民的身体健康。虽然我国许多养鸡场使用禽流感灭活苗,在一定程度上控制了禽流感的流行,然而如何区分免疫鸡群与感染鸡群却成为当前面临的一大难题。现有研究表明,非结构蛋白及其抗体可以作为病毒感染机体的一个重要标记。禽流感感染鸡体内产生禽流感病毒结构蛋白抗体和非结构蛋白抗体,而免疫鸡体内主要产生结构蛋白抗体,利用这种抗体差异,可用非结构蛋白区分免疫鸡群与野毒感染鸡群。因此,本研究基于该背景着眼于利用禽流感病毒非结构蛋白NS1基因,建立可区分免疫鸡群与野毒感染鸡群的快速鉴别诊断方法,为养禽业的稳定发展和人类健康,为最终控制和消灭这种疾病提供可靠依据和技术保证。主要工作包括: 1.AIV NS1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 根据禽流感病毒非结构蛋白(NS1)基因的序列,设计了1对针对NS1基因的特异性引物,从本室分离的毒株中扩增了H9N2亚型流感病毒的NS1基因。扩增的DNA片断大小约654bp,将其克隆到pMD18-T载体中,用SalⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定和序列测定后,进一步将其插入pET-28a中,构建了原核表达载体pET-28a-NS1,其在E.coli BL21(DE3)中以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达特异带约为30KD。斑点杂交及Western blot印迹分析证实表达产物具有抗原性。 2.NS1-ELISA的建立 将经纯化、变性、复性等处理后的NS1蛋白作为抗原,建立禽流感的NS1-ELISA鉴别诊断方法。方阵滴定确定抗原最佳包被浓度为1:80,即1.75μg/well,1:40为最佳血清稀释浓度。采集经禽流感(H9N2)亚型灭活苗免疫,经HI检测(?)阳性的份鸡血清,进行NS1-ELISA检测全为阴性,计算该94份血清的平均值(?),计算得(?)等于0.192,SD等于0.088,求得阴阳界限为0.369。以该方法检测126份已知背景鸡血清,结果表明,该方法诊断特异性为93.1%,诊断敏感性为94.4%。取6份抗体水平不同的血清样品在同一批试验中每份样品平行作6次(批内),又在6个不同试验日重复测定6份样品(批间),结果批内,批间重复的吸收变异系数均小于10%。说明此方法重复性好。以NS1-ELISA分别检测鸡新城疫、鸡马立克氏病、鸡传染性支气管炎、鸡传染性喉气管炎、鸡传染性法氏囊、鸡腺病毒Ⅰ型、鸡腺病毒Ⅲ型、鸡副流感的阳性血清,进行特异性试验的8份血清,检测全部为阴性,表明该方法