一、研究目的及意义:吴茱萸碱（Evodiamine）是一种吲哚喹唑啉生物碱,是中药吴茱萸的主要活性物质。迄今报道,吴茱萸碱具有较强的抗肿瘤活性,可以诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤组织的侵袭和转移、抑制肿瘤组织的血管生成、抑制多药耐药细胞株的活性等。本课题组前期研究亦证实,吴茱萸碱有显著的诱导肿瘤细胞凋亡的作用,在预实验中发现吴茱萸碱诱导肿瘤细胞凋亡的作用发生G2/M期阻滞,存在Delay-mitosis（D-mitosis,有丝分裂延缓）现象。有学者认为,只有在细胞周期调控中的有丝分裂纺锤体组装检验点（SAC）引起的D-mitosis和Mitotic-slippage（M-slippage,有丝分裂跳出）这两个事件都发生后,细胞凋亡才会发生。细胞凋亡与细胞周期是有着紧密联系的生命活动。不同因素诱导的凋亡,可发生在细胞的不同时相。那么,吴茱萸碱影响相应细胞周期的调控诱导肿瘤细胞凋亡的作用如何以及其诱导肿瘤细胞的凋亡是否与D-mitosis和M-slippage事件相关?这是本课题研究的目的。本研究对阐明吴茱萸碱诱导肿瘤细胞凋亡机制、凋亡与细胞周期调控的关系以及对吴茱萸碱的进一步开发应用都有很大的意义。同时阐明这一理论也将为进一步寻找更多针对细胞周期的有效中药成分和开拓以药物作用机制为靶点进行中药复方组方的理论打下基础,对传统中药的现代化具有深远的意义。二、研究方法:2.1吴茱萸碱对体外培养细胞的生长抑制作用。实验中选择人胃癌细胞SGC-7901、人肝癌细胞HepG2、大鼠肝癌细胞CBRH7919、Kidney、Liver小鼠原代细胞,MTT法观察吴茱萸碱对以上5种细胞生长的影响。通过流式细胞仪检测药物作用后对人胃癌细胞SGC-7901细胞周期、凋亡指数的影响,克隆集落形成实验观察克隆集落形成抑制率的影响,镜下观察细胞形态学的改变。2.2建立细胞周期同步化模型。采用胸苷嘧啶核苷酸（TD）双阻断法及血清饥饿法建立人胃癌细胞SGC-7901细胞周期同步化的细胞模型,选择最佳的方法。2.3探讨吴茱萸碱对SGC-7901细胞M期的影响。通过流式细胞仪对细胞周期、凋亡指数的检测寻找吴茱萸碱作用的可逆时间点。根据寻找到的可逆时间点,吴茱萸碱作用不同的时间后进行细胞凋亡的形态学、生化学检测;流式细胞仪对细胞周期、凋亡指数的检测;Western blotting分析CyclinB1、CyclinE的表达,彗星电泳检测,克隆集落形成实验观察。2.4构建不可降解CyclinB1（ND-CyclinB1）及全长CyclinB1（FL-CyclinB1）载体,探讨吴茱萸碱诱导细胞凋亡与细胞周期调控的关系。构建目的基因ND-CyclinB1与GFP的融合基因表达系统以及目的基因FL-CyclinB1与GFP的融合基因表达系统,运用流式细胞仪对细胞凋亡指数检测分析及荧光定量分析研究。2.5探讨吴茱萸碱影响细胞周期调控诱导凋亡的可能机制。通过JC-1染色观察线粒体膜电位的改变,微管蛋白α-tubulin的改变,Western blotting分析抗凋亡基因Survivin的表达。2.6吴茱萸合用青黛体内抗瘤实验。建立移植性肝癌（H22）昆明小鼠模型,从整体抗肿瘤作用进行研究,观察吴茱萸、青黛联合作用对荷瘤小鼠的一般情况、抑瘤率、瘤体积、生存期的影响。三、研究结果:3.1吴茱萸碱对体外培养细胞的生长抑制作用结果显示。①人胃癌细胞SGC-7901、人肝癌细胞HepG2及大鼠肝癌细胞CBRH7919三种肿瘤细胞在48hr内分别增长了0.9、1.13、1.39倍,Kidney及Liver原代细胞在48hr内分别增长了0.24和0.18倍;同时细胞的急性毒性实验显示,三种肿瘤细胞对1μM吴茱萸碱的敏感性也显著高于原代细胞。吴茱萸碱对分裂指数低的原代细胞无明显作用。②MTT实验结果显示吴茱萸碱对SGC-7901细胞的生长抑制作用呈时间和剂量依赖关系,IC₅₀为1.36μM。吴茱萸碱对肿瘤细胞的起效作用浓度低,小剂量的吴茱萸碱对肿瘤细胞即有明显的抑制作用。③流式细胞仪检测,经1μmol·L^-1吴茱萸碱作用12hr后G2/M期的细胞占到78.8%,但凋亡指数仅为4.1%与阴性对照组的4.4%无明显差别。作用24hr后细胞G2/M期的比例下降但凋亡指数增至了34.0%,36hr组G2/M期的比例为0.7%凋亡指数则是52.5%。④克隆集落形成实验筛选得2×10³cells/孔为6孔板中最佳实验用细胞密度。用0.25μM、0.5μM、1μM、2μM的吴茱萸碱作用24hr的集落形成抑制率分别为:32.37%、37.17%、48.21%、58.27%。作用36hr的集落形成抑制率分别为:31.3%、49.62%、56.23%、62.85%。⑤细胞形态学实验观察到典型的凋亡细胞形态学改变,如细胞的体积变小、空泡化、染色质的凝聚、核固缩、凋亡小体的出现。综上结果提示,吴茱萸碱具有显著抑制肿瘤细胞的生长和抑制肿瘤细胞分裂复制的能力,且这种抑制作用只对分裂指数高的细胞起作用,对低分裂指数细胞株和原代培养细胞生长无明显影响。吴茱萸碱通过直接诱导细胞凋亡而对肿瘤细胞起抑制作用。3.2建立细胞周期同步化模型。①经TD双阻断法诱导细胞周期同步化的方法,TD终浓度分别为2mM、4mM、8mM作用后,G0/G1期细胞数分别为77.3%、77.5%和77.0%,而G2/M期细胞数分别为2.0%、2.1%和2.1%。另一大组于上述TD双阻断后各释放12hr后分别收集细胞,TD终浓度为2mM、4mM、8mM的G0/G1期细胞数下降分别为44.0%、38.0%和36.6%,而G2/M期细胞数上升分别为39.9%、46.2%和49.1%,各期细胞数恢复正常范围。TD终浓度为2mM经双阻断法诱导SGC-7901细胞即可在短时间内获得大量可用于后续实验的G0/G1期细胞。②采用血清饥饿法诱导细胞周期同步化的方法,流式细胞仪检测显示,经无血清培养基分别培养24hr、30hr、36hr后,G0/G1期细胞数分别为57.4%、59.9%和68.4%,而G2/M期细胞数分别为11.4%、5.0%和10.1%。另一大组于上述血清饥饿法诱导各释放12hr后分别收集细胞,经无血清培养基分别培养24hr、30hr、36hr的G0/G1期细胞数下降分别为50.3%、51.4%和51.4%,而G2/M期细胞数上升分别为13.8%、22.7%和22.7%,各期细胞数变化不明显。且无血清培养基培养24hr、30hr及36hr组均出现典型的亚二倍体凋亡峰。综上结果提示,采用血清饥饿法诱导SGC-7901细胞周期化的方法不够理想。TD双阻断法诱导细胞周期同步化的方法是一种较理想的获得大量处于“基态”的细胞,即G0/G1期细胞的方法,且不存在TD浓度依赖。3.3探讨吴茱萸碱对SGC-7901细胞M期的影响。①寻找吴茱萸碱作用后可逆时间点实验中,1μmol·L^-1吴茱萸碱作用12hr后,凋亡指数为4.1%。作用16hr后,凋亡指数为4.0%,释放药物维持培养后凋亡指数为8.5%。作用20hr后,两类不同的处理方法的凋亡指数开始存在明显的差别,释放组的凋亡指数为40.4%要显著高于不释放组的凋亡指数16.0%。作用24hr、28hr、32hr和36hr释放组的凋亡指数均显著高于不释放组。因此,吴茱萸碱诱导SGC-7901细胞凋亡的可逆时间点在16-20hr之间。后续实验采用1μmol·L^-1吴茱萸碱分别作用16hr、20hr、24hr和36hr后予以研究。②Western Blot分析CyclinB1的水平,吴茱萸碱作用16hr后CyclinB1蛋白水平显著高于阴性对照。作用20hr后CyclinB1蛋白水平较之作用16hr发生显著下调,作用24hr及作用36hr组CyclinB1蛋白无明显表达。Western Blot分析CyclinE的表达,阴性对照组、1μmol·L^-1吴茱萸碱作用16hr、20hr及24hr组均未见表达,而作用36hr组出现特异性条带。结果CyclinB1随吴茱萸碱作用时间的增加表达下降,作用36hr后不表达,而CyclinE则在吴茱萸碱作用36hr后开始表达,提示吴茱萸碱作用36hr后经历了M期阻滞后跳出M期进入了G1期。③SGC-7901细胞为贴壁生长类型,呈多角形或菱形。PI染色,荧光显微镜下观察,吴茱萸碱处理16hr可看到染色体固缩呈三叉样;处理24hr后并不能看到明显的凋亡小体产生,大部分细胞仍处于染色体固缩的状态;处理36hr后出现大量的凋亡小体,同时多核细胞增加。④彗星电泳实验,受损伤的DNA泳出,在细胞后面形成长的拖尾。吴茱萸碱作用后细胞平均光密度值较阴性对照均降低,具有统计学意义。彗星尾距较阴性对照均增加,具有统计学意义,二者的改变与作用时间相关。⑤流式细胞仪检测,7.5μM CDK1I作用SGC-7901细胞凋亡指数为7.6%与阴性对照组的3.5%比较无显著差异。吴茱萸碱作用18hr后再加入CDK1I二者共同作用6hr后较单独吴茱萸碱作用24hr的凋亡指数均显著升高。0.5μM吴茱萸碱组的凋亡指数为8.9%,加入CDK1I共同作用组的凋亡指数则升至28.2%。1μM吴茱萸碱组的凋亡指数为20.0%,加入CDK1I共同作用组的凋亡指数则升至32.0%。抑制作用呈剂量依赖关系。⑥克隆集落形成实验以阴性对照组的集落形成抑制率0%为参照,7.5μM CDK1I作用SGC-7901细胞的集落形成抑制率为24.84%。吴茱萸碱作用18hr后再加入CDK1I二者共同作用6hr后较单独吴茱萸碱作用的集落形成抑制率均显著升高。0.5μM吴茱萸碱组的集落形成抑制率为38.01%,加入CDK1I共同作用组的凋亡指数则升至65.34%。1μM吴茱萸碱组的凋亡指数为49.81%,加入CDK1I共同作用组的凋亡指数则升至70.32%。⑦Dapi染色,光学显微镜下观察,阴性对照的细胞贴壁生长牢固,细胞明亮清晰,折光性好,充分伸展,细胞膜完整,细胞质分布均匀,核较大而圆,发出均匀的荧光。SGC-7901细胞经CDK1I作用后体积变大,贴壁能力增强。0.5μM及1μM吴茱萸碱组可见细胞变圆,染色质出现浓缩状态,出现凋亡小体。加入CDK1I 3hr左右即可见变圆细胞重新贴壁,同时至共同作用6hr后多核形态的细胞增加与PI染色细胞核改变现象类似。综上结果提示,吴茱萸碱影响细胞周期调控诱导SGC-7901细胞凋亡而发生肿瘤细胞的死亡,而凋亡的发生与D-mitosis事件的产生和维持4-8hr相关,协同发生M-slippage事件可增强凋亡作用。3.4构建不可降解CyclinB1（ND-CyclinB1）及全长CyclinB1（FL-CyclinB1）载体,探讨吴茱萸碱诱导细胞凋亡与细胞周期调控的关系。①经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析,目的基因ND-CyclinB1、FL-CyclinB1成功与GFP基因连接。插入处的密码阅读框与GFP的密码阅读框吻合,无移码突变产生。重组质粒pEGFP-N1-ND CyclinB1、pEGFP-N1-FL CyclinB1转染SGC-7901细胞,ND-CyclinB1、FL-CyclinB1基因在SGC-7901中都获得表达。②重组质粒转染SGC-7901细胞,经吴茱萸碱作用后流式细胞仪检测显示,阴性对照组的凋亡指数为4.1%。重组pEGFP-N1-ND与pEGFP-N1-FL经吴茱萸碱作用后二者的凋亡指数分别为38.2%和41.3%,与不经吴茱萸碱作用的凋亡指数14.5%和10.7%比较均差别显著。转染细胞经吴茱萸碱作用组的凋亡指数远不及非转染细胞经吴茱萸碱作用36hr的56.8%。③重组质粒转染SGC-7901细胞,经吴茱萸碱作用36hr后盲法摄取图像,采用盲法评分,评分结果可得重组pEGFP-N1-ND CyclinB1经吴茱萸碱作用组分值为3.60,均高于pEGFP-N1-FL CyclinB1及空载pEGFP-N1经吴茱萸碱作用的2.50与1.40。综上结果提示,重组质粒pEGFP-N1-ND CyclinB1与pEGFP-N1-FL CyclinB1的构建是成功的。采用让细胞长时间阻滞于M期无法进入下一细胞进程的方法可得出:吴茱萸碱诱导SGC-7901细胞凋亡而发生肿瘤细胞的死亡与其引起D-mitosis事件相关,阻断M-slippage事件可减弱凋亡作用。3.5探讨吴茱萸碱影响细胞周期调控诱导凋亡的可能机制。①应用JC-1观察细胞线粒体膜电位的改变,结果显示,阴性对照组红、绿色荧光均匀,红色荧光散布于细胞中。吴茱萸碱作用16hr后,红色荧光强度减弱,而绿色荧光强度增强,表明线粒体膜电位受到破坏。作用20hr,红色荧光强度显著减弱,而绿色荧光强度显著增强。作用24hr只见散在红色荧光,36hr后则视野中几乎无红色荧光。②荧光显微镜下观察α-tubulin微管蛋白的改变,阴性对照组的微管蛋白纤维清晰可见,呈细丝状,沿着细胞的长轴分布。作用16hr后可见微管蛋白纤维排列开始紊乱,断裂变短。作用20hr可见微管蛋白纤维发生弯曲,聚合状态发生改变,随着作用时间的增加,改变进一步加剧。至作用36hr微管蛋白聚合在一侧,荧光强度增加,纤维不再清晰可见,与紫杉醇作用36hr的微管蛋白改变类似。吴茱萸碱作用后使得细胞微管蛋白的聚合状态发生了改变。③Western Blot分析Survivin凋亡抑制基因的表达,实验中阴性对照组Survivin是高表达的,吴茱萸碱作用16hr后,Survivin的表达较阴性对照组即以开始下降,作用20hr、24hr及36hr则均已无Survivin的特异性条带出现。综上结果提示,吴茱萸碱通过影响细胞周期调控诱导SGC-7901细胞凋亡的作用机制可能与线粒体跨膜电位的丢失、影响微管蛋白聚合以及抑制Survivin基因的表达相关,是一个多靶点作用的过程。3.6吴茱萸合用青黛体内抗瘤实验。①动物整体水平研究选用皮下移植性小鼠（正常鼠）肝癌模型的方法,成瘤率100%。②实验一中,最终存活下来的小鼠一般情况以环磷酰胺组最佳,但环磷酰胺组仅存活5只。环磷酰胺组、吴茱萸组、青黛组以及联合组的抑瘤率分别为43.9%、35.6%、27.7%和37.2%。瘤体积比较结果表明:各治疗组瘤体积均较模型对照组小,各组间两两比较仅联合组与模型对照组间有统计学意义（p=0.048）。③实验二中,存活小鼠一般情况类似实验一部分。环磷酰胺组、吴茱萸组、青黛组以及联合组的抑瘤率分别为50.1%、44.9%、45.9%和51.9%。瘤体积比较结果表明:各治疗组瘤体积均较模型对照组小,且各治疗组与模型比较均有统计学意义。联合组与环磷酰胺组之间虽无统计学差异,但联合组的瘤体积平均值小于环磷酰胺组。同时,吴茱萸组、青黛组也均小于环磷酰胺组。进行生存期观察小鼠,当药物干预进行到第19d时环磷酰胺组陆续出现恶病质表现,体重明显下降,目光晦暗呆滞,弓背,张口呼吸,肉眼可见肿块虽较其他治疗组小但小鼠的一般情况远不及其他治疗组小鼠。各中药组改善移植瘤小鼠生存质量的优势显现了出来。药物作用30d后,不治疗继续观察至小鼠全部死亡,计算各治疗组的生命延长率。各治疗组较模型对照组均能延长存活时间,环磷酰胺组、联合组与模型对照组的平均存活时间之间具有统计学意义。环磷酰胺组、吴茱萸组、青黛组以及联合组的生命延长率分别为40.1%、36.04%、18.78%、70.05%,联合组要显著高于环磷酰胺组,但二者间差别无统计学意义。综上结果提示,吴茱萸合用青黛对移植肿瘤小鼠具有抗肿瘤作用,提示吴茱萸碱与靛玉红合用可以增加荷瘤小鼠瘤体生长抑制作用和延长荷瘤小鼠生存时间作用。四、结论:吴茱萸碱具有显著抑制肿瘤细胞的生长和抑制肿瘤细胞分裂复制的能力,且这种抑制作用可能具有细胞分裂指数选择性。吴茱萸碱对SGC-7901细胞持续作用16-20hr后即启动了细胞的凋亡程序。吴茱萸碱诱导SGC-7901细胞凋亡而发生肿瘤细胞的死亡,凋亡的发生既与D-mitosis事件的产生和维持4-8hr相关又与M-slippage事件的发生相关。吴茱萸碱通过影响细胞周期调控诱导SGC-7901细胞凋亡的作用机制可能与线粒体跨膜电位的丢失、影响微管蛋白聚合以及抑制Survivin基因的表达相关,是一个多靶点作用的过程。吴茱萸与青黛合用可以增加荷瘤小鼠瘤体生长抑制作用和延长荷瘤小鼠生存时间作用。吴茱萸碱作为抗肿瘤药具有极大的开发潜力。