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抗菌肽作为新型的潜在抗菌药物,在耐药问题日益严峻的今天引起了广泛关注。在对抗菌肽体外研究不断深入的同时,抗菌肽体内作用研究也逐渐成为关注重点。本研究第一部分对本组前期进行了体外研究的组合抗菌肽J-AA、J-AR和J-RR进行了体内安全性和抗菌活性评价。本研究的体内安全性通过急性毒性来评估,采用测定半数致死量(LD50)法,结果显示J-AR和J-RR毒性极低,J-AA的LD50为53.6mg/kg。抗菌活性采用在小鼠致病模型中的治愈率和血液中细菌含量来评估。J-AA、J-AR和J-RR在大肠杆菌致菌血症模型中均显示出显著的抗菌活性,而在大肠杆菌致小鼠腹膜炎模型中无治疗作用。在MRSA致小鼠感染模型中J-RR显示出显著的治疗作用,并且在高、中、低剂量分别为10,5,2.5mg/kg时的小鼠治愈率分别为100%,66.7%和33.3%,而J-AA和J-AR无治疗作用。本论文体内抗菌活性研究显示,我组前期设计合成的组合抗菌肽J-AA、J-AR和J-RR具有明确的选择性杀菌活性。本研究第二部分针对J-AA、J-AR和J-RR酶解稳定性较差问题进行了结构改造,对母肽Anoplin序列的7,8位,和母肽RW序列的1,5位进行D型氨基酸置换,然后通过1,3-偶极环加成反应侧链连接合成了新类似物J-AA-1、J-AR-1和J-RR-1。探讨同时应用D型氨基酸置换法和侧链连接策略进行结构改造后对抗菌活性、抗酶解能力、抗菌机制和溶血毒性等多方面的影响。研究结果显示,与母肽相比,新类似物的抗菌活性显著提高了232倍,并且未产生耐药性,但是,J-AA-1的表现比较复杂,其对革兰氏阴性菌活性提高28倍,但对革兰氏阳性菌却丧失了活性。杀菌动力学考察发现J-RR-1具有快速杀菌能力。酶解稳定性考察发现与不同浓度胰酶作用6h时,J-AA-1和J-AR-1的稳定胰酶浓度较母肽提高10倍,J-RR-1的稳定性较母肽提高了104倍。将J-RR-1与最大稳定胰酶浓度0.2mg/mL共孵育4h后涂布于培养皿中培养过夜,拍照显示仍能够完全杀死细菌。同时HPLC分析显示将肽在0.2mg/mL胰酶浓度中共孵育1h时母肽Anoplin和RW分别达到了82.3%和70.9%的降解率,而J-AA-1和J-AR-1的降解率仅为23.8%和17.1%,J-RR-1未降解,随着共孵时间的延长,在2h时母肽完全被降解,而J-AA-1和J-AR-1的降解率均低于50%,J-RR-1仍未被降解。对大肠杆菌外膜和内膜渗透性实验及PI摄取实验结果显示新类似物的作用机制同母肽一样均为迅速破坏菌膜;新类似物在浓度高达150μM时溶血率均低于1.5%,表明安全性较高。另外,圆二色谱检测发现在菌膜环境下三条新类似物均呈α螺旋结构。通过研究,我们发现同时应用D型氨基酸置换法和1,3-偶极环加成反应侧链连接策略对抗菌肽进行修饰在提高其活性、增加酶解稳定性及降低溶血作用方面均显示出较好效果。但是J-AA-1对金黄色葡萄球菌丧失活性,提示我们需要对Anoplin进一步探讨D型氨基酸置换位点,同时关注抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抗菌机理。本研究为今后对天然抗菌肽结构修饰改造研究提供了新的思路和方法,筛选出了体内低毒且具有广谱活性的抗菌肽J-RR和体外具有广谱活性低毒且稳定的抗菌肽J-AR-1和J-RR-1。该研究为新型抗菌肽的临床应用奠定了基础。