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地黄(Rehmannia glutinosa L.),玄参科多年生草本植物,是我国常用大宗药材,在临床上有广泛的应用,市场需求量大。但地黄实际生产长期受到连作障碍(即重茬问题)困扰,连作造成地黄植株生长不良,产量和品质明显下降,甚至绝收,且持续时间长达8年之久。连作障碍已经严重影响了地黄的可持续生产,成为制约当地中药农业和区域经济发展的重大问题。为了更深入得研究地黄响应连作特异的分子机制,本研究设置不同非生物胁迫(连作、干旱、涝害、盐胁迫、外源酚酸(某些植物的化感物质))处理,以头茬地黄为对照,利用数字基因表达谱升级版测序(RNA-SEQ)技术检测对照和不同处理间基因差异表达,构建不同胁迫处理下地黄数字基因表达谱。通过排除不同胁迫共同表达的基因,留下仅在重茬中的特异表达基因,本实验了构建地黄特异响应连作基因数字表达谱。对这些基因进行Agri GO分析,结合Nr、GO和KEGG功能分析的结果筛选出适合作为特异性分子Marker的“候选基因”。使用ORF Finder对无注释Unigene33449_All进行ORF预测。主要结果如下:经高通量测序在头茬对照(x1)、重茬(x2)、阿魏酸(x3)、盐胁迫(x4)、干旱(x5)、涝胁迫(x6)样品中分别得到281,603,980个、286,921,117个、297,077,935个、294,993,230个、289,115,190个和301565012个总碱基对(Total Base Pairs),经过去杂处理后,分别得到Clean Reads 5,747,020条、5,855,533条、6,062,815条、6,020,270条、5,900,310条、和6,154,388条。Clean reads比例接近,六个样品的Clean reads比例都在96.74%-98.81%之间,含adaptor序列是主要的杂质。各样本中80%以上的clean reads可被转录组注释,reads特异匹配基因比例(51.02%-54.56%)远高于多位点匹配基因的比例(29.28%-32.70%)。33%以上的注释基因的Clean Reads覆盖度达50%以上。reads在基因各部位分布得较为均一,说明在文库制备过程中m RNA打断的随机性很好,m RNA降解和偏向性的影响很小。Reads丰度表现部分冗余性,匹配的基因数目趋于饱和。以P-value值<0.005,FDR≤0.001且∣log2 Ratio∣≥1(倍数差异不低于2倍)的条件分别从重茬、阿魏酸、盐胁迫、干旱和涝胁迫基因表达谱中筛选到2502个、1956个、2672个、2485个和7249个显著差异表达基因,构建不同胁迫处理下地黄差异基因表达谱。对其进行了GO功能分类和KEGG代谢通路分析。GO和KEGG显著性富集分析表明,五种胁迫处理都影响到地黄的体内的许多相同或相似的生理生化过程,响应各胁迫的基因在GO富集条目和代谢途径上有明显重叠,验证了地黄体内存在的植物响应逆境胁迫的网络是存在交叉性的。地黄在胁迫下可能出现部分酶的催化活性减弱,如核酸合成、蛋白合成、糖类合成等初级代谢以及生物碱合成等次级代谢相关的酶类,进而影响到了细胞转运活性转导活性。致使地黄植株生物过程的调节和监管的混乱、光合作用、生长和发育的生物过程减慢,并很可能导致质体、类囊体和线粒体等有膜细胞器的损伤。当然也引起了植株抗逆响应机制的激活。通过排除不同胁迫共同表达基因,留下仅在重茬中表达的特异表达基因,并以FDR≤0.001且∣log2Ratio∣≥2为条件筛选显著差异表达基因,找出特异响应连作地黄的显著差异表达基因510条,对这些基因进行Agri GO分析,然后以FDR≤0.001且∣log2Ratio∣≥4为极显著差异条件,并结合差异表达基因Nr、GO和KEGG功能分析结果筛选适合连作障碍特异性分子Marker的“候选基因”57条,其中在连作地黄中上调的基因35条,下调的基因22条。经q RT-PCR验证后,筛选到较适合连作障碍特异性分子Marker的CL4723.Contig2_All和Unigene33449_All。使用ORF Finder对Unigene33449_All进行ORF预测,结果得到两个ORF区,并推导出了氨基酸序列。根据氨基酸序列使用NCBI的CCD工具预测出基因Unigene33449_All可能属于SDR蛋白家族,通过blastp结果显示Unigene33449_All还和多药耐药性蛋白转运载体(multidrug MFS transporter)ORF有较高的相似度。两种预测结果暗示Unigene33449_All可能与NAD(P)结合获得能量后,作为蛋白转运载体参与了抗逆蛋白向胞外主动运输的生物过程。