长期以来中枢神经系统(central nervous system,CNS)被认为是免疫豁免区,但近年来的研究表明,生理状态下免疫细胞可透过血脑屏障进入CNS。越来越多的证据也表明,免疫系统的功能对CNS的高级功能,如认知功能,有着重要的调节作用。长时程增强(Long-term potentiation,LTP)是指某些神经通路在接受到强直/高频刺激后突触活动长时间增强的现象,是突触可塑性的一种形式,被认为可能是学习记忆的神经生物学基础,作为研究学习记忆的一个重要模型而倍受关注,并已广泛应用于学习记忆的生理学和药理学研究。目前关于免疫功能对学习记忆功能影响的研究多数集中在免疫功能对学习记忆行为影响的观察上,关于免疫功能对LTP影响的研究报道较少。本研究首先建立和优化了小鼠在体海马LTP实验技术方法,进而选用几种不同免疫功能状态的动物模型观察比较了不同免疫功能状态与学习记忆行为和在体LTP变化的关系,最后探讨了六味地黄汤(Liuwei Dihuang decotion,LW)及其多糖活性成分CA4-3对糖皮质激素所致小鼠LTP损伤的影响及其可能机制。一、小鼠在体海马LTP实验技术方法的建立及优化LTP实验一般分为离体脑片记录和在体记录两大类。在体海马LTP的优势在于能较真实地反映生理状态下神经突触活动的情况,能够在整体条件下观察神经突触活动的变化,可通过口服、注射等整体给药的途径观察药物对神经突触可塑性的影响,利于从宏观角度研究和探讨神经系统药物的作用机理。长期以来,不论是在体还是脑片LTP的实验研究均多采用大鼠进行。由于小鼠海马体积较小、操作难度大,国外仅有个别实验室能够开展此方面研究,国内未见报道。但随着转基因小鼠、快速老化模型小鼠及许多免疫功能异常的小鼠在神经科学研究领域的应用,在小鼠模型上进行促智药物评价,以及进行学习记忆相关机制研究越来越多,因此我们首先建立了小鼠在体LTP实验技术方法,并针对该技术方法的技术难点进行了相应的改进。首先,针对不同品系小鼠颅骨大小变异大的特点,我们通过对比大鼠和小鼠脑立体定位图谱,发现大鼠与小鼠海马的绝对位置相差很大,但是相对于前囟的相对位置没有差异。基于此我们推测不同品系小鼠海马的相对位置也应一样,因此我们采用了相对定位参数对海马进行定位,即采用位置之间的比例代替具体距离。而后,在BALB/c小鼠上观察了电极不同深度与记录到的电位图的关系,确定了记录电极在海马齿状回(dentate gyrus,DG)颗粒细胞层及刺激电极在穿通纤维(perforant path,PP)时的电位图,以便依据诱发电位图的形状准确判断电极的位置。为了考察相对定位方法的正确性,我们进而选用了KM小鼠、裸鼠和不同月龄的SAM等不同品系的模型动物进行了验证比较了相对定位方法与绝对定位方法的一致性,以此验证相对定位方法的正确性。结果表明,相对定位法能准确的定位上述模型动物海马DG区和PP,可诱发出标准的群峰电位(population spike,PS)和LTP。最后,我们又对麻醉剂量、是否在颅骨表面滴加生理盐水、强直刺激参数及液接电位漂移等相关实验细节对LTP的影响进行了观察,进一步优化了实验条件,并确定了相应的标准化操作,为后期进行小鼠在体LTP实验提供了稳定可靠的实验技术方法。二、免疫功能状态与LTP之间的关系为了考察免疫功能状态与LTP之间的关系,本部分实验选用了多种具有不同特点的模型,包括:衰老导致的免疫功能紊乱模型——SAMP8;弗氏佐剂对免疫功能的非特异性刺激模型;特异性的T细胞功能缺陷模型——裸鼠;皮质酮导致的非特异性免疫抑制模型。1、SAMP8免疫功能和在体LTP的增龄性变化快速老化模型小鼠(Senescence-accelerated mouse,SAM)是一种出生后全身多系统功能发生快速进行性老化的模型小鼠,其中SAM-prone/8(SAMP8)是快速老化亚系之一,其特征是随增龄迅速出现中枢学习记忆功能和免疫功能衰退。大量研究表明,SAMP8的非空间型学习记忆能力下降最早可出现在2月龄,空间学习记忆能力下降最早可出现于4月龄,而其正常对照抗快速老化小鼠SAM-resistant/1 (SAMR1)或其它品系小鼠如C57BL小鼠在12月龄时尚未出现明显的学习记忆功能衰退。而我室以往的研究结果表明,SAMP8在1月龄时胸腺重量和胸腺淋巴细胞增殖能力即开始明显低于同龄SAMR1,提示SAMP8的免疫功能衰退最早可出现于1月龄。提示,SAMP8学习记忆衰退与免疫功能衰退之间可能具有一定的关系。本研究平行观察了SAMP8免疫功能的增龄性变化和在体LTP的增龄性变化,并对二者之间的可能关系进行了分析比较,旨在探讨SAMP8免疫功能衰退和学习记忆功能衰退之间的可能关系。1.1脾脏淋巴细胞增殖能力和亚群的增龄性变化采用3H-TdR掺入法观察了SAM脾细胞增殖反应能力的增龄性变化,结果表明,SAMP8脾细胞自发增殖反应、ConA诱导的T细胞增殖反应和以及LPS诱导的B细胞增殖反应均均成增龄性增加,但均明显低于同龄SAMR1,提示SAMP8的脾细胞增殖能力明显降低。淋巴细胞亚群分析表明,与同月龄SAMR1相比,2月龄SAMP8脾细胞中CD3+细胞(T细胞)比例明显下降,6月龄时有上升趋势,12月龄时明显上升;2月龄SAMP8的CD19+细胞(B细胞)比例明显上升,6、12月龄没有差异。T细胞亚群分析表明,SAMP8在增龄过程中,脾细胞CD4+或CD8+单阳性和CD4-/CD8-双阴性T细胞比例呈先降低后升高的趋势;SAMP8 CD4+或CD8+单阳性T细胞比例均低于同月龄SAMR1,而CD4-/CD8-双阴性T细胞比例均高于同月龄SAMR1。以上结果提示,SAMP8免疫功能在月龄时就已经明显衰退,不成熟T细胞(CD4-/CD8-双阴性T细胞)含量的增加可能是导致其免疫功能衰退的原因之一。1.2胸腺T细胞亚群的增龄性变化为了探讨SAMP8不成熟T细胞含量的增加是否由胸腺功能衰退所致,我们检测了SAM胸腺T细胞亚群的增龄性变化。结果表明,SAMP8胸腺细胞中,CD4+/CD8+双阳性T细胞比例呈增龄性降低的趋势,均明显低于同月龄SAMR1;CD4+或CD8+单阳性T细胞比例呈增龄性增加的趋势,均高于同月龄SAMR1,6、12月龄时接近脾细胞中CD4+或CD8+单阳性T细胞的水平。这些结果提示,在2月龄或更早SAMP8胸腺功能就已经明显衰退,6月龄以后可能由于胸腺结构破坏,导致外周T细胞进入胸腺,从而使CD4+或CD8+单阳性T细胞水平明显增加与脾细胞CD4+或CD8+单阳性T细胞细胞水平相近。进而导致了SAMP8免疫功能在2月龄或更早即发生了明显衰退,特别是T细胞功能的衰退。1.3海马组织细胞因子的增龄性变化细胞因子作为免疫系统发挥作用的重要物质,其对神经系统的功能起着重要的调节作用。所以,我们检测了海马组织中炎性因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α和抗炎因子IL-10的增龄性变化。结果表明,SAMP8在2月龄时TNF-α明显低于SAMR1,其余细胞因子与同月龄SAMR1没有明显差异。1.4在体LTP的增龄性变化已有研究表明LTP与学习记忆能力呈正相关关系。为了探讨免疫功能与学习记忆能力的关系,本研究观察了SAM在体LTP的增龄性变化。结果表明,SAMP8的PS增幅呈增龄性降低;与同月龄SAMR1相比,2月龄SAMP8的PS增幅明显升高,6月龄SAMP8的PS增幅明显降低,12月龄时没有明显变化。本结果与学习记忆相关行为不匹配,根据SAMP8学习记忆能力的增龄性变化情况, 2月龄及更大月龄SAMP8的PS增幅理论上均应低于同月龄SAMR1。1.5 LTP实验对局部海马组织细胞因子的影响LTP实验过程中,不可避免的会对海马组织造成损伤,这种损伤可明显增加炎性因子的表达水平。因此,LTP实验时海马局部组织细胞因子的水平可能是造成SAMP8在体LTP实验与学习记忆能力不相符的原因。本实验检测了LTP实验后的海马组织中炎性因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α和抗炎因子IL-10的变化。结果表明,与非实验侧海马组织相比,各月龄SAMP8和SAMR1实验侧海马组织中的IL-6和TNF-α均明显升高,其余细胞因子无明显变化;实验侧海马组织中,各月龄SAMP8的IL-6和TNF-α均低于同月龄SAMR1,其余细胞因子无明显变化;随月龄增长,SAMP8实验侧海马组织中IL-6含量呈增龄性降低,TNF-α含量呈增龄性增高的趋势,SAMR1实验侧海马组织中IL-6的含量随月龄增加先增加后降低,TNF-α含量随月龄增加呈增加趋势,其余细胞因子无明显变化。该结果提示,免疫功能较强可导致脑组织在LTP实验时急性炎症反应增强,进而释放较多炎性因子对LTP产生抑制作用。以上结果表明,SAMP8胸腺功能和T细胞功能在2月龄或更早即出现衰退,而其非空间学习记忆能力衰退最早发生于2月龄,空间学习记忆能力最早发生于4月龄,提示免疫功能可能是导致SAMP8学习记忆衰退的原因之一。免疫功能状态与LTP的诱发有着密切的关系,不同免疫功能状态所导致LTP诱发强度不同的原因可能与脑内炎性因子水平的差异有关。2、弗氏佐剂皮下注射对免疫功能、学习记忆相关行为和在体LTP的影响弗氏佐剂分为不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund’s Adjuvant,IFA)和完全弗氏佐剂(Complete Freund’s Adjuvant,CFA),两者对免疫功能的影响有一定差异。IFA偏向于诱导Th2型免疫应答,CFA偏向于诱导Th1型免疫应答;皮下注射IFA的动物脾细胞对LPS诱导的B细胞增殖反应强于皮下注射CFA的动物,对ConA诱导的T细胞增殖反应弱于皮下注射CFA的动物。所以,本研究选用两种弗氏佐剂刺激动物免疫功能,而后观察并比较其学习记忆行为和在体LTP的变化。以便进一步确认免疫功能对学习记忆能力和在体LTP之间的关系。BALB/c小鼠皮下注射IFA和CFA 7 d后用于实验。注射IFA后动物脾细胞对LPS诱导的增殖反应具有明显的增强作用,注射CFA动物脾细胞对ConA诱导的增殖反应具有明显的增强作用,提示IFA主要增强了B细胞的增殖能力,CFA主要增强了T细胞的增殖能力,与文献报道一致。行为学测试表明,IFA和CFA对自发活动均没有明显影响;IFA明显增强了穿梭箱反应的非空间型学习能力,对测试期反应的记忆能力具有一定的增强作用,但没有显著性差异;CFA对学习和记忆能力均有明显的增强作用;IFA和CFA对空间学习记忆能力均没有明显影响。以上结果提示,短期免疫功能增强对非空间型学记忆能力的影响可能大于对空间型学习记忆能力的影响。接着我们观察了IFA和CFA皮下注射对在体LTP和海马海马组织中炎性因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α和抗炎因子IL-10的影响。LTP实验表明,IFA组动物PS增幅有升高的趋势,CFA组动物PS增幅明显降低。细胞因子检测结果表明,各组非实验侧海马组织中,IFA明显降低了IL-6的水平,其余细胞因子没有明显差异;各组实验侧海马组织中,IFA明显降低了炎性因子IL-6的水平,明显增高了抗炎因子IL-10的水平,对其余细胞因子没有明显影响;CFA明显提高实验侧海马组织中炎性因子IL-1β、IL-2和TNF-α的水平,对其余细胞因子没有明显影响。本结果进一步提示,免疫功能状态不同可导致LTP实验时海马局部组织急性炎症水平的差异,进而可能造成LTP诱发水平的变化。此外上述结果还提示,T细胞功能增强有可能更易促进炎性因子水平的增加,但有待进一步证实。3、免疫功能重建对裸鼠在体LTP的影响裸鼠由于胸腺功能缺失主要表现为T细胞免疫功能缺陷,其学习记忆能力明显受损,用同源动物脾细胞进行免疫功能重建可明显改善其学习记忆能力。为了进一步明确免疫功能对在体LTP的影响,本研究又观察了免疫功能重建对裸鼠在体LTP的影响。用同源BALB/c小鼠脾细胞静脉注射重建裸鼠免疫功能,3周后用于实验,结果表明,免疫功能重建后其PS增幅明显降低,从而进一步提示T细胞功能增强可导致PS增幅的减小,其原因可能于LTP实验时海马局部炎性因子水平升高有关。4、皮质酮对免疫功能和在体LTP的影响糖皮质激素是AD、应激等导致认知功能障碍的重要因素,高水平的皮质激素对免疫功能具有明显抑制作用。本研究前期结果表明,免疫功能增强可导致LTP实验时局部炎性因子水平的升高,进而导致LTP受损的假象。为了探讨了免疫过度抑制对LTP的影响,本实验观察了急性皮质酮(corticosterone,Cort)皮下注射对动物免疫功能和在体LTP的影响。BALB/c小鼠皮下注射Cort 1.5 h后,用3H-TdR掺入法观察了脾细胞增殖反应。结果表明,25mg/kg Cort单次皮下注射1.5 h时脾细胞自发增殖反应、LPS诱导的B细胞增殖反应和ConA诱导的T细胞增殖反应均没有明显变化。海马组织细胞因子检测结果则表明,Cort能明显降低IL-1β和IL-2的水平。进而观察了体外应用Cort对脾细胞增殖反应及细胞因子分泌的影响,结果表明,Cort对脾细胞自发增殖反应和IL-2、IL-6和INF-γ等细胞因子的分泌具有明显抑制作用。在体LTP结果表明,Cort皮下注射1.5 h能剂量依赖性的抑制高频刺激后的PS增幅,提示其对LTP具有明显抑制作用。以上结果提示,Cort对免疫功能和LTP均具有明显抑制作用,脑内细胞因子水平被过度抑制可能是Cort损伤LTP的原因之一。三、六味地黄汤及其活性多糖益智作用机制的初步研究我们实验室前期研究表明,LW对SAMP8及皮质酮所致学习记忆障碍小鼠的学习记忆能力具有改善作用,对多种原因所致小鼠免疫功能紊乱具有调节作用,提示改善免疫功能可能是其发挥益智作用的途径之一。CA4-3是在免疫活性导向之下从LW中分离得到的活性多糖,是LW发挥免疫调节作用的主要活性成分之一。同时,我室以往研究还发现,CA4(以CA4-3为主要成分的LW活性部位)对麻醉大鼠LTP具有易化作用,提示对LTP的改善可能是LW发挥抑制作用的机制之一。为此,本实验在皮质酮皮下注射模型上,观察了LW及其活性成分CA4-3对LTP和免疫功能的影响,对LW和CA4-3益智作用机制进行了初步探讨。本部分实验采用强直刺激前1 h单次给药和连续给药7 d两种给药方式,首先在正常小鼠上观察了LW和CA4-3对LTP的影响,结果表明,单次给药和连续给药7 d均对正常BALB/c小鼠在体LTP没有明显影响;进而观察了LW和CA4-3对Cort致LTP损伤的作用,结果表明,单次给药和连续给药7 d均对Cort致LTP损伤有明显的改善作用,CA4-3只在连续给药7 d的条件下对Cort致LTP损伤有明显的改善作用。以上结果提示,LW和CA4-3对正常动物LTP无明显影响,但能明显改善Cort所致LTP损伤。为了探讨免疫调节在LW和CA4-3改善Cort致LTP损伤中的作用,我们又观察了LW和CA4-3对免疫功能的影响。首先观察了LW和CA4-3对整体动物脾细胞增殖反应的影响,结果表明,LW和CA4-3灌胃1周对BALB/c小鼠脾细胞的自发增殖反应和ConA诱导的T细胞增殖反应均具有明显的增强作用。实验前1.5 h皮下注射Cort对小鼠脾细胞的自发增殖反应和ConA诱导的T细胞增殖反应无明显影响,但可明显降低海马组织中IL-1β和IL-2的水平,CA4-3可明显改善Cort所致海马中IL-1β和IL-2水平的降低。体外实验表明,CA4-3在10-100μg/ml的浓度范围时能浓度依赖地增强脾细胞的自发增殖能力,并促进IL-2、IL-6和IFN-γ等细胞因子的分泌;Cort对脾细胞增殖反应及IL-2、IL-6和IFN-γ等细胞因子的分泌均具有明显抑制作用,CA4-3对Cort所致脾细胞增殖反应和脾细胞细胞因子分泌水平的降低均具有明显改善作用。提示改善免疫功能,调节细胞因子分泌可能是LW和CA4-3对抗Cort所致LTP损伤的作用机制之一。通过以上研究,可以得到以下初步结论:1.建立、优化了小鼠在体LTP实验技术方法,并验证了其稳定性和可靠性。2.免疫功能的衰退可能是SAMP8学习记忆能力衰退的原因之一,免疫功能状态与LTP诱发密切相关。不同免疫功能状态所导致LTP诱发强度不同的原因可能与脑内炎性因子水平的差异有关。3.免疫调节可能是LW和CA4-3改善Cort致LTP损伤的作用机制之一,调节细胞因子水平可能是其发挥作用的重要途径之一。