研究背景 随着科技的飞速发展,人口的增长,社会生活节奏的加快,人际间传统交流互动的方式正在逐步改变,人类社会工作、学习、生活的压力也在不断增加。越来越多工作、生活上的紧迫感、孤独感、束缚感所带给人类在身心上的困扰在逐渐走入医学界各类疾病研究的视线焦点。在心血管疾病中“双心医学”即所谓的精神心脏病学,正在吸引来越来越多临床医生在诊疗疾病过程中关注、探讨和尝试应用的目光。抑郁症、心血管疾病同时被列为增加全球疾病负担的两大身心疾病,两者在临床上相互伴发,引发了研究者很多相关的思考。近年来,心血管疾病伴发或者心血管疾病先发性诱导的抑郁症等相关情绪应激精神类疾病及其对患者病程、预后的影响受到了医学界极大的关注。同时研究和防治精神-心理疾病和心血管疾病,被作为身心医学的一个分支被赋予了“双心医学”这样一个名词去定义。目的 本实验以双心医学、心脑血管疾病气血理论为指导,大鼠心肌缺血合并情绪应激模型为依托,借助超声检测、行为学实验、分子生物学等技术方法,通过对照观察心肌缺血大鼠(ISO模型组),心肌缺血复合情志刺激大鼠(复合模型组),正常大鼠(空白组),服用益气活血药方大鼠(中药组)以及服用阳性对照药物大鼠(西药组),五组动物的心电图,超声心动图(EF、FS),相关行为学,以及对大鼠心肌组织、脑海马体、血液中P物质、脂联素、乙醛脱氢酶2、内皮素、一氧化氮含量的不同,研究探讨心、脑的相关性,情绪应激与心血管疾病的相关性；研究揭示P物质、脂联素、乙醛脱氢酶2、内皮素、一氧化氮在双心疾病中可能起到的关联作用。对比益气活血中药、阳性对照西药在其中的药物作用效果,阐明双心医学观念在心血管疾病预防治疗中的重要性,给临床治疗用药组方提供坚实的实验依据。观察情绪对ISO模型大鼠血清、心肌组织,海马体中相关物质含量以及蛋白表达特异性的影响,佐以大鼠行为学的前后变化,研究探讨情绪应激在大鼠心血管疾病病程中所产生的影响以及中药的作用环节,为该药早期干预改善心肌动力等方面的研究、临床提供依据。方法 实验包括五个部分1 实验一 在大鼠适应性饲养后,采用连续三天,大鼠腹腔注射异丙肾上腺素(ISO)的方法构建大鼠心肌缺血模型,用药剂量为5mg/kg/d,构建大鼠心肌缺血、心衰模型,空白组不进行干预,假手术组采用腹腔注射等量生理盐水的方法进行操作。腹腔注射三天后,密切观察两天,再进行相应药物的灌服。药物灌服30天后,进行超声心动图等一列心脏功能指标的检测,最终以心电图Q波增多、ST段的改变或者超声心动图检测EF、FS的降低,作为模型成功标准。2 实验二 在实验一心肌缺血模型构建的基础上,建立慢性非可预见性应激刺激下的心肌缺血动物复合模型。三天连续腹腔注射异丙肾上腺素ISO,观察两天。动物情况稳定后,模仿现代生活人类的压力和情志刺激,增加情绪应激。采用情绪干扰法,利用黑瓶束缚(压力孤独束缚)、饥饿、口渴空瓶应激(欲求不得)、昼夜颠倒等方法对大鼠进行情志上连续30天的刺激,在情时对相应药绪应激的同物组灌服益气活血药无和阳性对照药物,其余组灌服等量生理盐水,对不同组在不同时间点上进行相关指标的对比,在用药后第32天行超声检测、心电图测试；在造模前、用药后第14天、用药后第30天进行旷场实验；在用药后第14天和第30天进行糖水实验,在整个实验的过程中对心率、体重、排泄次数等相关指标进行记录、观察。将旷场实验和糖水实验辅佐造模动物体重、排泄的指标作为情绪应激模型成功的标准。3 实验三在实验二复合模型的基础上连续30天灌服益气活血中药和西药培哚普利,腹主动脉取血,低温离心制备血清,采用ELISA法检测大鼠血清NO、ET-1、P物质的含量,进行这些指标不同组间的对比。4 实验四、实验五采用RT-PCR法检测目标物质在大鼠不同部位的含量,在实验三动物取材的基础上,快速取心肌组织和脑海马体,对比各组间ALDH2、P物质、脂联素在心肌组织和脑海马体中基因层面含量的变化情况。结果 实验结果包括五个部分：1 实验一腹腔注射成功构建大鼠心肌缺血模型后,观察造模前后空白组、假手术组、IS0模型组、中药组、西药组大鼠在心率、心电图、超声心动图上的变化：空白组、假手术组的大鼠均无明显变化；腹腔注射药物造模后,部分大鼠出现心率忽快忽慢,或者减慢的状况；经过一段时间的药物治疗：中药组、西药组均有部分大鼠发生心电图、超声心动图上的改变。造模灌服相关药物后第32天,对各组实验动物分别进行心电图检测,见到ST段改变以及部分Q波的存在。超声检测,观察心脏超声相关指标(FS、 EF),对结果进行整理、记录。经过分析发现ISO模型组对比空白组和假手术组在EF、FS上的降低,有统计学意义(P<0.05),说明腹腔注射药物造模起到了作用。服药后,药物组相对于模型组的EF、FS在数值上有所增加,有统计学意义(P<0.05)。在心体指数上存在一定变化,ISO模型组相对于空白组和假手术组,LVM/BM增加,有统计学意义(P<0.01),药物组对比模型组心体指数降低,有统计学意义(P<0.05)。此外实验表明,腹腔注射ISO造模,死亡率在可接受范围内,可以继续进行下一步的目标实验。2 实验二 复合模型构建后,结果发现第14天复合模型大鼠出现活动减少、喜暗、惧怕人、排泄物增多,后几天食量减少等状况。在第32天,对实验大鼠进行心脏超声等相关检测,如实验一,复合模型组、ISO模型组与空白组相对比,均在心功能EF FS上存在显著降低(P<0.01)；复合模型组与ISO模型组对比,差异相对较小,但确实存在心功能相关数值降低的趋势(P=0.058)。药物组相对于复合模型组EF、FS升高,差异显著(P<0.05)。在进行的旷场实验和糖水偏嗜实验中,结果显示,复合模型大鼠在直立攀爬、横向移动上都存在减少趋势,其好奇心明显降低,对糖水的偏嗜程度也降低(小于实验开始前的20%)。在观察中发现复合模型大鼠均表现出容易受惊,喜静喜暗,糖水偏好降低,在陌生环境中不安,排泄物增多,对刺激挣扎抵抗度降低等行为,可见情绪刺激达到了一定的效果,但中药组相对于西药组和复合模型组在应激性、耐受性以及情绪易变性上明显表现较好。情绪刺激除了对大鼠心理和行为学上产生了一定的影响外,在心脏功能等方面也产生了影响,可以初步断定双心疾病模型的构建基本成功,且存在一定价值和意义,益气活血中药确实对动物情志和行为学产生了一定的影响,初步从实验上断定了继续本实验研究的意义。3 实验三 用ELISA法检测大鼠血清NO、ET-1、SP的含量,对比各组指标,进行统计学分析发现,ISO模型组、复合模型组血清NO、ET-1、SP含量均明显高于空白组(P<0.01),复合模型组与空白组的差异大于ISO模型组与空白组的差异(P<0.05),说明情绪应激对心血管疾病确实会起到影响；中药组、西药组大鼠血清NO、ET-1、SP均略高于空白组,而低于两个模型组(P<0.0或<0.05),说明药物起到了一定的作用。4 实验四 在双心疾病复合模型的构建基础上,应用RT-PCR技术观察实验五组大鼠基因层面心肌组织和脑海马体中ALDH2水平的差异。将益气活血中药对复合模型大鼠心肌组织和脑海马体中所含ALDH2水平的影响与西药组进行对比。将复合模型大鼠、ISO模型大鼠与正常大鼠在该指标上的变化进行对比。结果表明,复合模型组该指标在脑海马体中明显低于ISO模型组和空白组(P<0.01)；ISO模型组相对于空白组该物质含量并没有下降,无显著差异；给药两组脑海马体ALDH2旨标含量对比空白组差异性不大,中药组和西药组对比不明显。在心肌组织中,检测对比结果与脑海马体相反,心肌组织中该物质在复合模型组中偏高,明显高于空白组(P<0.01)；ISO模型组也高于空白组(P<0.01),药物作用组相对于模型组降低,P<0.05。中药组相对于西药组治疗降低趋势明显(P=0.062),说明中药在对心肌组织ALDH2含量的影响上效果显著。5 实验五 在复合模型建造的基础上,用RT-PCR技术检测各组大鼠心肌组织和脑海马体中脂联素在mRNA层面的表达情况。结果显示,在脑海马体中,该物质含量在复合模型组中最低,与空白组比较差异明显(P<0.01)；ISO模型组与空白组相比也存在显著差异(P<0.01)；药物组与模型组相比,该物质在基因层面存在含量升高的趋势(P=0.064),可能由于样本量较少,有待于后续实验进一步研究证实。在心肌组织中,脂联素水平在两个模型组中较空白组含量降低明显(P<0.01),药物组含量较模型组升高,有统计学意义,中药组较西药组效果明显(P<0.05)。结论 腹腔连续三天注射异丙肾上腺素构建大鼠心血管疾病的方法可行,通过心电图超声指标的检测证实了心血管系统的病变,造模动物死亡率在可控制范围内。心肌缺血合并情绪应激的复合模型构建存在一定的研究意义和价值,造模动物死亡率在可控范围内。情绪应激对心肌缺血模型动物的行为学产生了一定影响。益气活血中药方可能通过影响心肌组织中ALDH2的含量,改善心肌缺血大鼠的心肌动力,心肌代谢水平,增加射血分数,增加心肌供血,对心肌组织中ALHD2影响较明显,心血管疾病对该物质海马体中的影响可能并不是很显著,情绪对其影响较为大。实验初步证明情绪和心血管疾病可能共同通过神经调节,共同对P物质产生影响,进一步直接、间接启动相关内分泌系统,影响NO、ET-1基因水平的含量,保护血管内皮的功能,其通过影响受损内皮细胞的功能,来对细胞进行修复,通过增加局部心肌组织的血流灌注量,提高心肌细胞的供血,改善心脏的微循环功能状态,调节微循环的血流灌注,从而对因为氧气减少,血流不畅等缺血缺氧症状造成的组织形态、功能、代谢状态的改变进行抑制和逆转。研究结果表明,情绪刺激和心血管疾病均对脑海马体中脂联素含量产生影响,该物质可以作为两疾病的桥梁；益气活血药可能通过影响脂联素在脑海马体、心肌组织中的含量,抑制炎症反应,抑制细胞凋亡等等,从而保护心脏,减缓心血管疾病向不良病程的方向发展。此外,益气活血中药也同时通过影响脑以及相关神经体液调节因素,影响疾病模型大鼠的心理状态,从而从内外共同影响以上相关指标的变化,良性促进疾病病程缓和、好转、向愈。创新点 本文通过微观角度研究情绪与心血管疾病的相关性,在“气血理论”“双心医学”理论指导下,研究了益气活血中药对心血管疾病以及情绪相关指标的共同作用机制,具有实验研究贴近临床诊疗疾病的创新性；运用免疫组化方法、RT-PCR等相关技术从心脑相关性,情绪与心血管疾病相关性上,探讨了双心医学模式思维下,益气活血法调节情绪应激状态心肌缺血动物复合模型的机理,具有实验研究,临床应用的新颖性。