目的和意义:神经系统疾病是人类的常见病和多发病,但许多神经系统疾病的发病机制尚未被完全阐明,同时也缺乏对这些疾病治疗的有效方法。近年来,将诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSCs)应用于各种神经系统疾病的发病机制及治疗研究已成为神经系统研究领域最活跃的组成部分,给神经系统疾病治疗带来了希望。iPSCs是将体细胞重编程而获得的多潜能干细胞,具有自我更新及多向分化的潜能,可运用于神经系统疾病模型建立、药物筛查及移植治疗等多个方面。将iPSCs定向分化为神经系统细胞是iPSCs在神经系统应用的前提。到目前为止,虽然iPSCs可以在体外成功分化成为运动神经元细胞,多巴胺能神经元细胞,星形胶质细胞等,但是我们对于iPSCs神经定向分化的调控机制尚未完全明确,对影响iPSCs神经定向分化的相关因素及调控机制需要进一步的研究。抗氧化基因1(oxidationresistancegene1,oxr1)是2000年发现的一个保守基因家族,在真核生物细胞内发挥着重要的抗氧化作用。此外有研究发现oxr1还具有保护神经细胞,延长肌萎缩侧索硬化症小鼠模型生存期的作用。人类和小鼠oxr1都具有四个rna转录亚型,分别为oxr1a,oxr1b,oxr1c,oxr1d,且oxr1a只在人类和小鼠中枢神经系统(centralnervoussystem,cns)中表达。这种oxr1a的表达特性提示oxr1a可能与神经系统的发育或者功能具有密切关系。结合oxr1在细胞里重要的抗氧化功能,我们推测oxr1a可能影响ipscs的增殖和神经定向分化功能。在前期工作中,我们的研究团队已成功地利用基因捕获技术建立了oxr1a基因敲除小鼠模型,本课题在此基础上,将oxr1a基因敲除小鼠的胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblasts,mefs)重编程成为ipscs。通过建立了oxr1a基因敲除的ipscs细胞模型,以研究oxr1a对于ipscs的增殖以及神经定向分化能力的影响及可能的相关机制。方法:在第一部分实验中,首先通过逆转录病毒将oct4、sox2及klf4转染至oxr1a基因敲除的mefs中,将其重编程为ipscs,再通过基因型鉴定以验证oxr1a基因敲除ipscs细胞模型的建立。其次,进行干细胞蛋白标记物nanog、rex1、oct4及sox2的免疫荧光染色、碱性磷酸酶染色及将ipscs随机分化后进行外胚层标记物tuj1,中胚层标记物sma,内胚层标记物afp的免疫荧光染色以定性验证ipscs。此外,我们还通过实时荧光定量pcr(realtimequantitativepcr,qpcr)检测了干细胞蛋白标记物nanog、rex1、oct4及sox2的表达水平、oxr1及oxr1a在ipscs随机分化模型中表达量的变化。在第二部分实验中,首先利用mtt检测细胞相对活性的方法,绘制了ipscs增殖曲线以检测oxr1a对于ipscs增殖能力的影响,还检测了在不同浓度的过氧化氢处理后野生型和oxr1a基因敲除型ipscs内细胞相对活性的变化。同时还通过qpct检测ipscs线粒体dna编码的相关基因(12s、nd1、nd3、cytb及cox1)的表达水平、dna拷贝数以了解线粒体功能的变化;此外运用qpcr定量测定dna损伤检测法(real-timeqpcranalysisofdamgesfrequency,radf)检测ipscs的线粒体和核dna损伤水平的变化,以检测oxr1a对于ipscs的线粒体和核dna损伤的影响;最后,应用流式细胞仪测定了ipscs细胞周期的变化及通过qpcr测定了ipscs内抗氧化功能相关基因(p21、nrf2、gpx2、p53、caspas9、caspas3、foxo1、foxo3、dusp1及fos)表达水平,以探求oxr1a对于ipscs增殖影响的可能机制。在实验第三部分,利用noggin诱导ipscs定向分化为神经干细胞(neuralstemcells,nscs),通过aggrewell培养盘法定量比较神经干细胞神经球的的形成率;进一步利用分化培养基诱导nscs分化成神经细胞,通过qpcr法比较野生型及oxr1a基因敲除型nscs分化后神经标记物基因(gfap、map2、nestin、pax6、sox1和tuj1)的变化,并通过对分化后的神经细胞进行tuj1免疫荧光染色,检测了oxr1a对ipscs分化成神经元数目的影响。通过直接测量野生型及oxr1a基因敲除型神经球的直径和计算神经球的数量检测oxr1a对于由ipscs诱导的形成神经球大小及增殖速度的影响。此外通过mtt法检验了nscs增殖能力和抗氧化能力的变化。通过流式细胞仪技术检测ipscs的ros的表达水平,检测oxr1a基因敲除型ipscs内ros水平的变化。最后,为进一步了解oxra对于ipscs神经定向分化影响的可能机制,我们通过qpcr方法检测了ipscs神经分化后抗氧化功能相关基因(p21、nrf2、gpx2、p53、caspas9、caspas3、foxo1、foxo3、dusp1及fos)核酸表达水平的变化。结果:第一部分实验结果:通过基因型鉴定显示野生型ipscs和oxr1a基因敲除型ipscs具有不同的基因型,确认了oxr1a基因敲除ipscs细胞模型建立成功。野生型ipscs和oxr1a基因敲除型ipscs干细胞标记物nanog、rex1、oct4及sox2免疫荧光染色、ap染色均为阳性,nanog、rex1、oct4及sox2基因表达比mefs明显增高,以上结果显示oxr1a基因敲除后不影响mefs重编程为ipscs。此外,我们发现oxr1和oxr1a的表达量在ipscs随机分化模型中随着分化而逐渐增加。第二部分实验结果:与野生型ipscs相比较,oxr1a基因敲除型ipscs增殖能力减弱,抗氧化能力下降,其线粒体dna拷贝数比野生型ipscs数值低,流式细胞仪检测发现oxr1a基因敲除型ipscs内g1期细胞比率比野生型ipscs明显增加;我们还发现oxr1a缺失引起ipscs内过氧化氢酶gpx2表达的降低,p53及caspase9表达增加。但我们未发现ipscs的线粒体dna编码相关基因表达及线粒体和核dna损伤出现明显变化;以上结果表明oxr1基因敲除会导致ipscs的增殖能力的降低,其机制与oxr1a基因敲除后会导致ipscs内p53表达增加,过氧化物酶gpx2表达的降低,进一步引起caspase9表达增加,抗氧化能力下降及细胞周期改变有关。第三部分实验结果:利用Noggin方法成功诱导野生型和OXR1A基因敲除型iPSCs分化为NSCs,但OXR1A基因敲除型iPSCs诱导形成NSCs的神经球效率比野生型iPSCs低,进一步向神经细胞分化后OXR1A缺失会导致TuJ1表达降低以及在分化第7及14天TUJ1阳性神经元数量的减少,表明了OXR1A基因敲除会降低iPSCs分化为NSCs及进一步分化为神经元细胞的能力。进一步发现,OXR1A基因敲除型iPSCs诱导形成NSCs的神经球比野生型体积稍小及数量较少,其增殖能力及抗氧化能力降低。另外,通过流式细胞仪检测ROS方法,我们还发现OXR1A基因敲除型iPSCs内ROS水平在内源性氧化压力和在外源性氧化压力存在的条件下都比野生型iPSCs增高。最后,通过比较野生型及OXR1A基因敲除型细胞在iPSCs、NSCs及神经细胞三个不同状态相抗氧化作用的反应酶系统的表达差异,我们发现在iPSCs阶段,OXR1A基因敲除会导致iPSCs内Gpx2的降低,p53及caspase9的升高;在NSCs阶段,OXR1A基因敲除会引起NSCs内Ho-1的降低和p53的升高;在神经细胞分化阶段,OXR1A基因敲除会导致p21,FOXO3及Dusp1的降低和caspase9的升高。结论:本实验结果表明OXR1A基因缺失会导致iPSCs增殖及神经定向分化能力的下降,证明了OXR1A在iPSCs增殖及神经定向分化中具有重要作用。OXR1A对iPSCs增殖及神经定向分化调节的机制为:OXR1A缺失后可能通过p53/p21信号通路降低Gpx2、Ho-1,Dusp1及FOXO3等抗氧化物酶的表达,引起细胞内ROS水平的增高而诱发了氧化应激及改变了iPSCs的细胞周期从而影响了iPSCs的增殖和分化能力。