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缺血再灌注(ischemia reperfusion, I/R)损伤是一个全身性的反应,某个器官的I/R损伤可引起其他器官不同程度的损害,即远程器官的次级损伤。氧自由基(oxygen free radical, OFR)是外源性氧化剂或细胞内有氧代谢过程中产生的具有很高生物活性的氧分子。生理状态下,体内产生的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等能迅速清除OFR,防止OFR的堆积。I/R以后,缺血和缺氧的直接结果是营养物质的缺乏和ATP生成的减少,从而导致OFR的大量产生,当超过机体的清除能力时,体内还原物质被消耗,即可直接损伤组织和诱导细胞凋亡。褪黑素(melatonin, MT)是目前发现的体内最强的抗氧化物质之一,能有效清除体内OFR。研究证实,MT对心、脑、肝、小肠和胰腺缺血再灌注损伤均有明显的保护作用,而关于其对I/R后引发的远程器官次级损伤的作用鲜有报道。本实验旨在采用生化、免疫组织化学、流式细胞术等方法观察褪黑素对肾脏缺血再灌注损伤(renal ischemia reperfusion injure, RIRI)引发的远程器官次级损伤的作用,并探讨其可能的作用机制。第一部分MT对RIRI大鼠心肌OFR和细胞凋亡的影响目的:观察MT对RIRI大鼠心肌的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法:采用夹闭大鼠双侧肾动、静脉45分钟后松夹再灌注的方法制作RIRI模型,观察MT对RIRI大鼠心肌的影响。32只SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、缺血再灌注24h组(I/R)、褪黑素组(MT)、阳性对照维生素C组(VC),每组8只。I/R组、MT组和阳性对照VC组均夹闭双侧肾动、静脉45分钟,然后去夹再灌。MT组于夹闭前30分钟和再灌后30分钟腹腔注射MT 10 mg/kg,VC组于夹闭前30分钟和再灌后30分钟分别腹腔注射VC 125mg/kg,IR组则同法给予等量生理盐水。再灌注后逐层缝合腹膜、腹壁肌肉和皮肤。Sham组除不夹闭双侧肾动、静脉外,余手术操作同前三组。再灌注24小时后取腹主动脉血,测定血清肌酐(Scr)、血清尿素氮(SUN),取血后迅速摘取心脏,测定心肌组织MDA含量、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和SOD活性,留取相同部位组织标本做病理形态学观察(HE染色),并测定心肌细胞凋亡率(流式细胞分析技术)以及Bcl-2和Bax的表达(免疫组织化学)。结果:RIRI导致肾脏、心肌明显损伤,表现为:1与Sham组相比,I/R组Scr、SUN及心肌组织MDA含量均明显增加(P <0.01),LDH和CK活性明显增强(P <0.01), SOD活性则明显减弱(P <0.01);与I/R组相比,MT组Scr、SUN及心肌组织MDA含量均明显降低(P <0.01),LDH和CK活性明显减弱(P <0.01,P <0.05),而SOD活性明显增强(P <0.05); MT组与VC组比较无明显差异。2 I/R组肾小管上皮细胞明显受损,以近曲小管为重,表现为肾小管管腔扩张,管内可见管型和脱落细胞,上皮细胞核染色质边集,胞浆空泡变性、坏死,心肌组织可见有少量凋亡细胞及炎性浸润;MT组及VC组肾小管损伤范围和程度均明显小于和轻于I/R组,肾小管上皮细胞核基本正常,管内仅见少量管型,心肌未见明显病理改变。3 I/R组的心肌细胞凋亡率(20.76±2.02%)明显高于sham组(2.66±0.53%)(P<0.01), MT组、VC组的心肌细胞凋亡率分别为(13.40±0.96%)、(13.49±1.51%),明显低于I/R组(P<0.01)。4 sham组Bcl-2与Bax蛋白表达较少,I/R组Bcl-2与Bax蛋白表达增多,与I/R组相比,MT及VC组Bax蛋白表达减少,而Bcl-2蛋白表达增加。结论:MT对RIRI大鼠心肌有一定的保护作用。其作用机制可能与其清除氧自由基,上调Bcl-2表达、下调Bax表达,抑制心肌细胞凋亡有关。第二部分MT对RIRI大鼠脑组织OFR、NO和细胞凋亡的影响目的:观察MT对RIRI大鼠脑组织的保护作用,并探讨其作用机制。方法:模型制备和实验方法同第一部分。各组采用硝酸还原酶法测定组织NO,并测定组织iNOS活力。结果:RIRI导致肾脏、脑组织明显损伤,表现为:1与Sham组相比,I/R组Scr、SUN、脑组织MDA、NO含量均明显增加(P <0.01),iNOS活性明显升高(P <0.01),SOD活性则明显降低(P <0.01);与I/R组相比,MT组Scr、SUN、脑组织MDA、NO含量均明显降低(P <0.01),iNOS活性明显降低(P <0.05),而SOD活性明显升高(P <0.05);MT组与VC组比较无明显差别。2 I/R组肾小管上皮细胞明显受损,以近曲小管为重,表现为肾小管管腔扩张,管内可见管型和脱落细胞,上皮细胞核染色质边集,胞浆空泡变性、坏死;MT组及VC组肾小管损伤范围和程度均明显小于和轻于I/R组,肾小管上皮细胞核基本正常,管内仅见少量管型。I/R组神经细胞间隙增宽,部分退变的神经元呈凋亡特征,细胞皱缩成圆形或卵圆形,核染色质固缩、边集;MT及VC组神经细胞较I/R组有明显改善。3 I/R组的神经细胞凋亡率(23.53±3.13%)明显高于sham组(3.24±0.71%)(P<0.01),MT、VC组的细胞凋亡率分别为(13.81±2.01%)、(14.20±1.51%),明显低于I/R组(P<0.01)。4 sham组Bcl-2与Bax蛋白表达较少,I/R组Bcl-2与Bax蛋白表达增多,与I/R组相比MT及VC组Bax蛋白表达减少,而Bcl-2蛋白表达增加。结论:MT对RIRI大鼠脑组织有一定保护作用,其作用机制可能与减弱iNOS的活性,使具有毒性作用的NO合成减少及抑制神经细胞凋亡有关。