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肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是世界范围内恶性程度最高的肿瘤之一,占肝脏恶性肿瘤的80%-90%。肝细胞肝癌的死亡率非常高,严重危害人类健康。因此,研究肝细胞肝癌的发生机制有重要意义。MicroRNAs (miRNAs)及其功能和调控机制的的发现为这一问题的解决带来了新的契机。MiRNAs是一类非编码小RNA (Ribonucleic Acid,核糖核酸)分子,通常在转录后水平调控基因表达。MiRNAs能够和互补或部分互补的靶mRNA (message Ribonucleic Acid信使核糖核酸)的3’-UTR (Untranslated Regions非编码区)区结合,使mRNA降解或介导其翻译抑制。研究表明,miRNAs对靶基因的调控在肝细胞肝癌的发生发展过程中起重要作用。MiR-122在人类和小鼠的肝脏、原代培养肝细胞以及肝细胞系都有高水平表达,占肝脏全部miRNAs的70%。对人类和哺乳动物肝癌组织标本以及肝癌细胞系的检测发现,miR-122表达显著下调,这提示miR-122参与肝细胞肝癌的发生发展。但是这些研究均没有涉及HBV (Hepatitis B Virus,乙型肝炎病毒)相关肝癌。研究表明,HBV感染与HCC发生发展存在密切联系。本课题组在前期研究中利用HBV转基因小鼠自发肝癌的特点,以BALB/c来源的HBV转基因小鼠作为天然的肝癌模型组,与同系同龄的BALB/c小鼠对照,研究肝癌形成过程的不同时段肝脏基因组、蛋白质组和miRNAs的动态变化。其中,miRNAs芯片的结果显示miR-122表达下调。同时课题组还在转染了HBV表达载体的BEL-7402-HBV细胞的：miRNAs芯片结果中发现miR-122表达下调。在转染了HBV表达载体的HepG2.2.15细胞中,miRNAs的qPCR (real-time quantitative Polymerase Chain Reaction实时荧光定量多聚酶链式反应)结果显示与HepG2细胞相比HepG2.2.15细胞中：mR-122的表达相对下调,这提示1niR-122下调参与HBV相关肝癌发生发展。但是miR-122是通过那些靶基因起调控作用?这些靶基因又在HBV相关肝癌的发生发展中起了什么作用?为了解答以上问题,在前期工作的基础上,我们开展了miR-122对HBV感染及其相关肝癌的基因调控机制的研究。目的：1.筛选miR-122的靶基因。2.构建miR-122表达载体。3. MiR-122表达载体转染HepG2.2.15细胞,研究niR-122对靶基因的调控机制和对HBV相关肝癌的影响。方法：1.利用数据库、相关软件、细胞系和人肝癌组织标本RT-PCR (Reverse Transcript PCR逆转录PCR)检测并参考基因芯片结果,筛选miR-122的靶基因1.1利用数据库,及相关软件筛选miR-122的靶基因,并预测二者的二级结构利用TargetSca、MiRanda预测miR-122的理论上的靶基因,预测结果中包括NDRG3(N-Myc downstream regulated gene3 N-Myc下调基因3)。利用RNAhybrid预测1miR-122与NDRG3的二级结构。1.2在转染了HBV的肝癌细胞系HepG2.2.15及人HBV相关肝癌组织标本中检测靶基因NDRG3的表达水平培养细胞HepG2.2.15、HepG2,提取总RNA,通过RT-PCR反应,检测NDRG3在HepG2.2.15细胞系表达水平。参照小鼠基因芯片的结果进一步筛选miR-122的靶基因。收集HBV相关肝癌患者癌组织(T),癌旁组织(A)共22组,提取总RNA,通过RT-PCR,检测NDRG3在癌组织和癌旁组织中的表达差异。2.荧光定量PCR检测miR-122的表达水平分别提取HepG2.2.15、HepG2的总RNA,反转录为cDNA (complementaryDNA),使用设计合成的miR-122引物进行qPCR反应,检测HepG2、HepG2.2.15中miR-122的表达水平。3.构建miR-122表达载体设计、合成miR-122前体cDNA序列的特异性引物,在前引物的5’端悬垂BamHⅠ酶切位点,在后引物的5’端悬垂HindⅢ酶切位点,并加保护碱基。收集HepG2.2.15细胞,提取基因组DNA作为模板,PCR扩增获得相应的miR-122前体cDNA序列片段。收集PCR反应产物经酶切,纯化,定向克隆入真核表达载体pSilencer3.1-H1 neo内,产物命名为pS-miR122;同时,构建阴性对照载体pS-control。载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5a,经抗性筛选、酶切、DNA测序鉴定获得目的重组质粒。4.将miR-122表达载体转染HepG2.2.15细胞,研究miR-122对HBV相关肝癌的调控机制4.1将pS-miR122和pS-control转染HepG2.2.15细胞pS-miR122及pS-control分别转染肝癌细胞HepG2.2.15。4.2转染后检测转染48小时后,实时荧光定量检测转染前后各组miR-122表达量的差异,RT-PCR, qPCR检测NDRG3 mRNA水平的表达差异；转染72小时后,Western blot检测NDRG3蛋白水平的表达差异。转染48小时后,ELISA, HBV-DNA定量检测HepG2.2.15转染miR-122表达载体对HBV复制、表达的影响。转染后,CCK8、流式细胞术检测转染后HepG2.2.15细胞增殖、凋亡的变化。结果：1.成功筛选出miR-122的一个靶基因NDRG3通过TargetScan、MiRanda预测NDRG3为miR-122的靶基因。通过RNAhybrid得到了miR-122与NDRG3的二级结构。小鼠基因芯片的结果中NDRG3上调,miR-122下调；与癌旁组织相比,HBV相关肝癌组织中NDRG3上调；与HepG2相比,转染了HBV的肝癌细胞系HepG2.2.15中NDRG3上调,miR-122下调。以上结果显示：在HBV相关肝癌中miR-122的表达与NDRG3的表达负相关。MiR-122表达载体转染HepG2.2.15细胞使miR-122过表达后,检测发现NDRG3的表达下调。其中,RT-PCR及qPCR结果显示转染表达载体组NDRG3的mRNA水平明显低于对照组,Western blot结果显示转染表达载体组NDRG3的蛋白水平明显低于对照组。这证明了miR-122对NDRG3的负性调控作用,说明NDRG3是miR-122的靶基因。2. MiR-122对HBV复制、表达有明显的抑制作用HepG2.2.15细胞转染miR-122表达载体pS-miR122后,ELISA检测HBV表面抗原,e抗原的表达与对照组相比明显受到抑制；HBV-DNA定量检测也显示转染表达载体组HBV-DNA的表达量明显低于对照组。3.转染了miR-122表达载体的HepG2.2.15细胞增殖受到明显抑制CCK8结果显示转染表达载体组与对照组相比,NDRG3的表达下调,HepG2.2.15细胞增殖受到明显抑制。结论：1. NDRG3为miR-122的一个靶基因,miR-122可下调NDRG3的表达水平。2. MiR-122可抑制HBV的复制和表达。3. MiR-122通过下调NDRG3的表达水平,抑制了HepG2.2.15细胞的增殖。意义：1.本研究通过多种途径,筛选并验证了miR-122的一个靶基因NDRG3,明确了miR-122对NDRG3的基因调控机制在HBV相关肝癌中的作用。2.本研究成功构建了miR-122表达载体,并成功转染HepG2.2.15细胞,抑制了HBV的复制和表达。所以,miR-122表达载体pS-miR122在抑制HBV感染和防止肝癌发生方面有潜在的开发价值,本研究也为临床预防和治疗提供理论依据和实验支持。3.本研究利用miR-122表达载体下调了NDRG3基因的表达,抑制了HepG2.2.15细胞的增殖,从反向证明了HBV可能通过上调NDRG3基因的表达水平来促进HBV相关肝癌的细胞增殖。进一步阐明了miR-122对HBV感染及其相关肝癌的基因调控机制。