普通针毛蕨(?)acrothelypteris torresiana (Gaud.) Ching是金星蕨科针毛蕨属植物,主要分布于我国长江以南各省区。由于该植物具有亲热解毒,软坚散结的功效,在民间常被用于止血和治疗水肿。已有文献报道,普通针毛蕨中所含的主要成分Protoapigenone具有良好的抗肿瘤活性,且对诸多肿瘤细胞都表现出明显的细胞毒作用。本实验室研究发现,由该植物首次提取制备的黄酮类化合物2-(顺-1,2-二羟基-4-酮-环己-5-烯)-5,7-二羟基-色原酮(DEDC)是Protoapigenone的结构类似物,对多种肿瘤细胞也呈现出显著的增殖抑制活性。近年来不断发现,植物黄酮(flavonoids)集许多优良的生理、药理学活性于一身,在癌症及心血管疾病的预防、治疗方面以其天然、高效、低毒的特点而倍受瞩目。黄酮类化合物抗肿瘤机制的报道常常见诸报端,但是总的来说,其具体的防癌、抗癌机理目前尚未明确。近一两年国外研究者在植物黄酮抗肿瘤研究方面取得了突破性的进展,发现许多药物具有的抗氧化与促氧化活性、生物膜保护作用、线粒体毒性损伤、蛋白酶体抑制反应、信号转导抑制与调节功能在抗肿瘤效应及诱导肿瘤细胞凋亡方面起关键作用。植物黄酮结构上属于多酚类植物化合物,一直被认为是高效的天然抗氧化剂。事实上,植物黄酮作为功能物质起效时,同时具有抗氧化与促氧化两种截然相反的特性。人们通常把植物黄酮对疾病的预防作用归因于其具有良好的抗氧化活性及自由基清除特性。事实上,这些多酚类化合物在抗癌及诱导肿瘤细胞凋亡方面,其促氧化活性起着比抗氧化更为重要的作用。研究表明,这些植物多酚类物质能催化谷胱甘肽(GSH)或辅酶Ⅰ氧化而产生活性氧(ROS),而许多化疗药物能诱导细胞核DNA片段化引起不可逆损伤并促使肿瘤细胞凋亡都是通过ROS介导产生的。目前,对于黄酮类化合物DEDC的抗肿瘤作用机制并不十分清楚,认为至少可能包括以下两个方面：1.DEDC通过在细胞内的促氧化作用,造成氧化压力,引起氧化应激而损伤生物膜、DNA及其它生物大分子诱导肿瘤细胞凋亡。2.通过在较高浓度下产生ROS调节某些细胞信号转导途径,如：丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs);转录信号传导子与激活子3(STAT3);核转录因子κB (NFκB)等的活性,继而调节细胞生理过程的各个方面,包括细胞的增殖、分化和凋亡本研究用DEDC处理人肝癌细胞HepG2以及人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y后,采用台盼蓝拒染法、MTT比色法、流式细胞术(flow cytometry, FCM)凝胶电泳迁移实验(EMSA)、免疫印迹实验(Western-blot)、和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)等方法分别检测HepG2及SH-SY5Y细胞在DEDC处理后,细胞DNA损伤情况和凋亡相关基因及蛋白表达水平的变化。为了进一步阐明ROS及有关细胞信号分子在肿瘤细胞凋亡中所起的作用, ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC), JNK1/2抑制剂SP600125, P38 MAPK抑制剂SB203580被用于实验,测定ROS、JNK、P38等信号分子在DEDC诱导的HepG2细胞凋亡中起什么作用；同时,NAC和NF-κB抑制剂PDTC被用于检测ROS和NF-κB对SH-SY5Y细胞凋亡的影响。第一部分DEDC对HepG2细胞毒性作用及其凋亡机制的研究鉴于黄酮类化合物protoapigenone展示出较强的抗癌活性,本试验旨在探讨其结构类似物2-(顺-1,2-二羟基-4-酮-环己-5-烯)-5,7-二羟基-色原酮(DEDC),种首次从普通针毛蕨分离得到的黄酮类化合物,对肝癌细胞HepG2的生长抑制作用及其诱导凋亡的分子机制,同时为进一步检测了ROS捕获剂NAC及MAPK通路抑制剂对DEDC诱导,实验设计中采取了对细胞预先用不同抑制剂加以处理的方法再观察肿瘤细胞凋亡效应的变化。将肝癌细胞HepG2和肝正常细胞LO2分别暴露于DEDC (2.5,5, 10μg/ml)或protoapigenone (2.5,5,10μg/ml) 24 h后,使用台盼蓝染色法、流式细胞术、和Western blot技术检测了细胞存活率、凋亡百分比、胞内ROS积累、线粒体膜电位变化情况及Procaspase-3,-8,-9、Bcl-2家族成员、MAPK通路蛋白等凋亡相关因子的蛋白表达水平。结果显示：与正常肝细胞相比,肝癌细胞HepG2对DEDC高度敏感(#P<0.1),而protoapigenone对上述两种细胞株均有明显的生长抑制作用。在DEDC处理的HepG2细胞中我们检测到持续而快速产生的活性氧自由基ROS并伴随着细胞膜电位的降低,当细胞用NAC预孵育后ROS水平的升高及细胞电势的降低则均被取消。从免疫印记实验可知,在DEDC的处理引起了HepG2细胞中细胞色素C从线粒体向胞浆释放,Procaspase-3,-8,-9的降解,Bcl-2/Bax比值减小,JNK、P38MAPK信号传导途径的磷酸化激活。细胞分别经各抑制剂预处理后,则发现NAC及JNK特异性抑制剂SP600125显著地抑制了DEDC诱导的细胞凋亡,而P38特异性抑制剂SB203580则促进了DEDC诱导的凋亡反应。综上所述,DEDC在一定剂量水平上能显著抑制肝癌细胞HepG2的增殖而对肝正常细胞L02损伤微小,显示出良好的生物活性。DEDC诱导的凋亡与胞内ROS水平上升明显相关,而且从免疫印记实验也证明ROS介导的Bcl-2和Caspase途径依赖的线粒体功能紊乱是DEDC诱导HepG2细胞凋亡的重要机制。同时,JNK和P38 MAPK信号通路也参与了对凋亡的调控,但JNK的活化表现为正向调节作用而P38 MAPK信号通路则表现为负性调节效应。第二部分DEDC对SH-SY5Y细胞毒性作用及其凋亡机制的研究神经母细胞瘤是儿童常见的恶性实体肿瘤之一。目前,该病的发生机制尚不明确,是临床治疗及实验室研究的热点和难点。本研究拟探讨黄酮类化合物DEDC对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y增殖活性的影响及信号转导和转录活化因子3(STAT3)、核因子κB(NF-κB)信号转导通路在凋亡过程中的调节作用。将神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、肺腺癌细胞A549、前列腺癌细胞PC-3、人乳腺癌细胞MCF-7暴露于DEDC (2.5,5,7.5,10μg/ml) 24 h后,通过MTT比色法,求出各细胞株的半数抑制率(ICso值)。凝胶电泳迁移实验(EMSA)检测了将SH-SY5Y细胞暴露于DEDC (7.5μg/ml)不同时间(3h,6h,12 h,24 h)后,核内NF--B蛋白结合活性的变化情况。Western blot检测了SH-SY5Y细胞暴露于不同浓度的DEDC (2.5,5,7.5, 10μg/ml)后,STAT3、NF-κB、p53、p21、Bcl-2、Bax等凋亡相关蛋白的表达情况。为进一步阐明ROS及NF-κB信号分子在SH-SY5Y细胞凋亡中的作用,我们使用荧光染色法、流式细胞术、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术对比了存在和不存在ROS捕获剂NAC或NF-κB特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)时,细胞凋亡百分比、细胞周期分布、胞内ROS积累、及NF-κB、P53、Bcl-2、Bax等凋亡相关基因的mRNA和蛋白表达水平的变化。结果显示：四种肿瘤细胞的ICso值范围从5.2-g/ml到11.5μg/ml,其中SH-SY5Y细胞的IC5o值最低,说明该种细胞对DEDC最敏感,因此被选择作为实验对象。与对照组比较,DEDC诱导的细胞早期凋亡率、G2/M期阻滞的细胞比例、胞内ROS水平的上升均有显著性差异。DEDC能有效抑制转录信号传导子与激活子3(STAT3)通路的异常激活是该化合物诱导肿瘤细胞凋亡的重要机制之一。通过检测抑制剂对凋亡的影响,发现DEDC诱导SH-SY5Y细胞凋亡是胞内ROS积累继而引发一连串凋亡级联反应的结果,抗氧化剂NAC能显著抑制ROS的产生并阻断DEDC诱导凋亡活性；核转录因子KB(NF-κB)在SH-SY5Y细胞凋亡过程中被活化,而抑制NF-KB通路能显著增强肿瘤细胞对DEDC促凋亡效应的敏感性,DEDC与PDTC联用对引发SH-SY5Y细胞凋亡呈现明显的协同效应。综上所述,人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y对DEDC高度敏感,凋亡作用的产生与DEDC能增加肿瘤细胞ROS的积累密切相关。在凋亡过程中,DEDC通过ROS介导的对STAT3信号转导通路的负性调节是该化合物诱导凋亡的重要作用机制；凋亡调节蛋白P53、P21、CyclingB1、Bcl-2、Bax均参与了对SH-SY5Y细胞凋亡的调控；NF-KB通路被激活在DEDC诱导的细胞凋亡反应中起到了抗凋亡作用,因此抗肿瘤药物与NF-κB通路抑制剂的联合使用可能成为今后临床治疗的一个新方向。