蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn)，豆科蝶形花亚科苜蓿属一年生黄花苜蓿，耐旱、耐瘠薄，澳大利亚有分布。该植物自花受粉且易于转化，二倍体基因组小，是植物生物学研究常用的模式植物，其基因组测序已完成。本文为了获得林木耐旱分子改良所必须的的目的基因，以生物信息学、分子生物学、基因工程和细胞工程等手段，从蒺藜苜蓿克隆获得3个干旱响应元件结合转录因子类基因MtDREBs和木葡聚糖转葡糖苷酶基因MtXET;改进了为鉴定基因功能的基因拼接方法；鉴定了MtDREB1C和MtDREB2A的耐寒耐旱、耐旱耐盐功能和MtXET根系发生功能。具体成果如下： 1.在电子克隆基础上，从蒺藜苜蓿植物材料中克隆获得3个DREB类基因MtDREB1A、MtDREB1C和MtDREB2A(简称为MtDREBs)，1个MtXET基因；在GenBank登录，登录号分别为：DQ778006、DQ267620、DQ908959、DQ855285。 序列分析结果表明，MtDREB2A、MtDREB1A和MtDREB1C分别编码309，215和227个氨基酸多肽，并都含有保守的N-末端核定位信号和DNA绑定AP2域；MtXFT编码310个氨基酸，含有保守的CH16域和木葡聚糖转葡糖苷酶C-末端。 2.改良MtDREB2A组成结构，提高其转录活性。 MtDREB2A的AP2域后第142-190位氨基酸残基有一个丝氨酸/苏氨酸富含区，通过用长引物PCR的方法剪除该区后，得到命名为MtDREB2a的新基因。酵母单杂交结果表明，MtDREB2A和MtDREB2a能特异绑定DRE元件；但只有MtDREB2a能激活报告基因的转录活性，这说明MtDREB2A的转录活性在剪除丝氨酸/苏氨酸富含区后被激活了。原核表达结果表明，MtDREB2a能在大肠杆菌中表达，而MtDREB2A不能在大肠杆菌中表达。蒺藜苜蓿转基因结果表明，MtDREB2A的过量表达对转基因植株的生长没有明显的抑制作用；MtDREB2a的过量表达可以改变转基因植株的根冠比，引起地上部分植株生长明显迟滞，而对根的生长没有抑制作用。 3.建立月季转DREB基因技术体系，并鉴定了MtDREB1C的整合表达功能。 MtDREB1C被构建到含rd29A启动子的pCAMBIA1301植物表达载体中用于月季转化，获得一个再生转基因株系，PCR和Southem blotting结果表明，MtDREB1C已整合到月季基因组中；生理测试结果表明，转基因植株的耐寒性比对照明显增强。 4.以RNA干扰鉴定了MtXET促进根系发生的功能。 RNA干扰结果表明，在蒺藜苜蓿胚根中过量表达MtXET(反义)-GUS(spacer)--MtXET(正义)发夹结构，会明显抑制根系的发生和生长。 5.在基因功能鉴定过程中，发现了用长引物PCR法进行快速有效基因剪接时的一个关键因子，进一步揭示了长引物PCR法进行基因剪接的反应机制。 优化的长引物PCR法可以用来构建RNA干扰表达载体，也可用来构建DRE串联子。运用该方法进行基因剪接时，不用考虑酶切位点、酶切体系和酶切连接的效率，快速、简单、有效。