棉蚜Aphis gossypii (Glover)属半翅目蚜科,是棉田重要的农业害虫之一。目前对棉蚜的化学防治和抗性研究已经做了很多的工作,由于实验条件以及实验技术的限制,这些研究仅集中在对不同杀虫剂的毒力测定以及对与抗性有关的靶标的分子鉴定等方面。目前并没有系统的、更深层次的对棉蚜的抗性机理及毒理学特性进行研究,因此了解昆虫抗性形成的机制与毒理学特性是目前预防昆虫抗性形成的主要的研究工作之一。1.本研究从棉蚜全基因组出发,根据生物信息学信息分析,全面的对敏感品系棉蚜nAChRs亚基鉴定。通过分子克隆,共获得了8个nAChRs亚基序列,其中包括7个α亚基和1个β1亚基,在这些α亚基中,其中α4亚基和α7亚基存在选择性剪切体。对克隆得到的氨基酸序列与其它昆虫的nAChRs亚基序列进行同源性比较和序列特征分析,发现所有的nAChRs亚基序列具有6个与配体结合有关的Loops (LoopA-F),以及四个与离子通道形成有关的跨膜序列(TM1-4)。同时在α亚基序列中,含有2个典型的α亚基的半胱氨酸的残基。与其它模式昆虫通过基因组测序获得的nAChRs亚基序列建立进化树分析,发现通过分子克隆获得的各亚基序列与其它昆虫相应的昆虫具有很高的同源性。通过分子克隆得到所有nAChRs亚基,有利于对于各亚基的功能研究,从而建立各个亚基与不同杀虫剂之间的对应关系,为目前广泛开展的杀虫剂机理研究、选择性机理研究和抗药性机理研究提供新的研究思路和基础,并直接与杀虫剂的结构优化和分子设计密切相关。2.新烟碱类杀虫剂作为mAChRs的选择性激动剂拥有硝基(-NO2)和氰基(-CN)基团,从第一代吡虫啉的出现到现在广泛使用第四代新烟碱类杀虫剂氟啶虫胺氰的面世,经过近三十年的发展,新烟碱类杀虫剂经历了四个世代和数种杀虫剂。在本部分研究中,我们选择了四种代表性的新烟碱类杀虫剂用于检测新烟碱类杀虫剂对于棉蚜nAChRs亚基结构与功能的关系。研究结果显示,对于棉蚜nAChRsα1亚基,吡虫啉、噻虫嗪、和氟啶虫胺氰引发的最大内部电流分别是乙酰胆碱的9.35%,48.9%和81.3%,噻虫嗪和氟啶虫胺氰的EC50与乙酰胆碱的相似,而吡虫啉是其乙酰胆碱的1.76倍,此三种新烟碱类杀虫剂对棉蚜α1亚基的EC50的趋势与生物测定的LC50的趋势是一致的。显著性相关性分析发现,在本研究中这三杀虫剂对棉蚜的LC50和EC5o值存在显著性的相关性关系。外源表达系统中对于呋虫胺的研究中发现,当浓度为0.1mM时,引发的内部的电流很微弱,增加呋虫胺浓度到1mM时,引发的内部的电流几乎变化,因此推测在棉蚜中呋虫胺的结合位点可能不是α1亚基。这些结果显示新烟碱类杀虫剂拥有的硝基和氰基基团对nAChRs选择性可能有直接的作用。3.现在农药市场中,约40%的注册农药属于手性农药。在本部分的研究中,我们对手性农药呋虫胺和其两个对映单体的毒理特性进行了研究。首先,我们根据已报道的意大利蜜蜂的mAChRs基因组测序结果进行了分子克隆,获得了全部的nAChRs受体序列,将获得的全部意大利蜜蜂的α亚基序列连接到外源表达载体中,我们尝试利用爪蟾卵母细胞结合双电极电压钳初步研究了意大利蜜蜂nAChRs受体亚基对于手性农药呋虫胺的影响。蛙卵外源表达系统研究显示,在检测的所有的mAChRsα-型亚基中,只有AmeIα1,AmeIα3,AmeIα8引发了对Ach的内部电流,其它的a-型亚基暂时没有检测到内部电流。蛙卵表达结果显示,AmeIα1-β2和AmeIα3-β2对rac-呋虫胺和两个单体S-(+)-呋虫胺和R-(-)-呋虫胺对没有引起明显的变化差异。但是与rac-呋虫胺和单体S(+)-呋虫胺相比,AmeIα8-β2的蛙卵表达结果显示R-(-)-呋虫胺发生了明显的右移,这与对成年意大利蜜蜂生物毒性的测定结果是一致的,即单体S-(+)-呋虫胺>rac-呋虫胺胺>R-(-)-呋虫胺,根据毒性测定的结果和毒理学测定结果显示,我们推测R-(-)-呋虫胺相对于S-(+)-呋虫胺和rac-呋虫胺对蜜蜂的毒性更低。因此从降低对蜜蜂的毒性角度和环境污染的角度出发,我们建议对呋虫胺的单体进行分离。