研究背景和目的:阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)是一种酵母样真菌,可导致侵袭性、播散性感染。T.asahii导致的播散性毛孢子菌病,致死率高达80%。T.asahii感染人体的结局,主要与宿主的免疫防御状态和菌株对抗真菌药物敏感性这两方面因素有关。本研究应用人全基因组寡核苷酸芯片检测了人THP-1单核细胞与T.asahii体外相互作用3小时后的基因表达谱变化,有助于理解宿主单核细胞对T.asahii感染的免疫防御机制。研究表明,单核细胞的吞噬功能明显弱于巨噬细胞,而单核细胞只占外周血白细胞总数的3%-8%,这可能是其难以抵挡T.asahii入侵,导致血源性、播散性感染的原因之一。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor,GM-CSF)作为一种重要的集落刺激因子,可促进造血干细胞向中性粒细胞和单核/巨噬细胞分化、增殖。我们进一步研究了GM-CSF对单核细胞吞噬、杀伤T.asahii功能的影响,探讨应用GM-CSF辅助治疗T.asahii感染的可能性。研究表明,T.asahii感染所致的播散性毛孢子菌病,其高死亡率与菌株耐药及T.asahii形成生物膜的能力密切相关。由于研发新型抗真菌药物周期长,投资巨大,在已有药物中发掘抗真菌药物增效剂成为近年来抗真菌感染领域的研究热点。为了解决临床常见的T.asahii耐药问题,我们查阅了国内外关于抗真菌药物增效剂的相关文献,选择舍曲林及盐酸小檗碱作为药物增效剂,进行了体外药敏试验,观察它们联合应用氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑及两性霉素B对T.asahii游离细胞及生物膜是否有协同抑制作用,试图筛选出既有协同抗菌作用,又可抑制生物膜形成的辅助治疗药物。方法:第一部分:人THP-1单核细胞对T.asahii感染的基因表达谱反应1.1×107人THP-1单核细胞与5×107CFU的T.asahii细胞在37℃RPMI 1640液体培养基中混合培养3小时。Trizol一步法提取THP-1细胞中的总RNA。应用人全基因组寡核苷酸芯片检测人THP-1单核细胞与T.asahii体外作用3小时的基因表达谱变化,应用SAM软件以2倍标准筛选差异表达基因,进一步应用DAVID6.7生物信息学分析系统对差异表达基因进行基因功能聚类分析。2.Real time PCR检测部分差异表达基因m RNA的表达,以验证基因表达谱数据。3.ELISA法检测TNF-α、IL-1β及CCL3在蛋白水平的表达变化,以验证基因表达谱数据。第二部分:粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对人THP-1单核细胞抗T.asahii感染活性的增强作用1.GM-CSF对人THP-1单核细胞吞噬T.asahii的影响:将1cm×1cm大小的圆形盖玻片置于24孔板,加入500μl浓度为1×105/ml的人THP-1单核细胞。实验组加入终浓度为100、200、400U/ml的重组人GM-CSF,37℃、5%CO2细胞培养箱中预孵育48小时。对照组加入不含重组人GM-CSF的RPMI 1640液体培养基。48小时后,每孔加入500μl浓度为5×105 CFU/ml的T.asahii菌悬液(MOI=5:1),37℃、5%CO2条件下共培养1小时,吸弃上清液,PBS轻柔洗涤2遍,取出圆形盖玻片置于载玻片上,加瑞氏-姬姆萨染液进行染色、固定,自然干燥后在显微镜下观察THP-1细胞对T.asahii的吞噬现象。2.GM-CSF对人THP-1单核细胞杀伤T.asahii功能的影响:96孔板每孔加浓度为1×105/ml的人THP-1单核细胞悬液100μl,同时各实验组分别加入终浓度为100、200、400U/m的重组人GM-CSF,置于37℃、5%CO2培养箱中孵育48h,对照组加入不含重组人GM-CSF的RPMI 1640液体培养基。48小时后,弃上清液,用RPMI 1640液体培养基洗2遍,每孔加入浓度为5×106 CFU/ml的T.asahii菌悬液100μl,37℃、5%CO2条件下共培养1小时。吸取上清液转移到另一96孔板;原96孔板每孔加入100μl 2%的Triton X-100作用10分钟,裂解THP-1细胞;取细胞裂解后释放出的T.asahii的上清液与裂解前上清液混合,混匀后倍比稀释100倍。吸取200μl,加入15ml 50℃的SDA真菌培养基中,摇匀、凝固后于37℃真菌培养箱倒置培养48h,观察每个平皿形成的菌落数,计算每毫升的T.asahii菌落形成单位(CFU/ml)及对T.asahii的生长抑制率。第三部分:舍曲林、盐酸小檗碱联合抗真菌药物对T.asahii游离细胞及生物膜的体外协同抗菌作用1.舍曲林、盐酸小檗碱联合抗真菌药物对T.asahii游离细胞的体外药敏试验:(1)21株T.asahii临床株的复苏、纯化与菌液制备;(2)96孔药敏板的制备;(3)最低抑菌浓度(MIC)的结果判读:采用肉眼观察比较各孔与生长对照孔的浊度变化来判断MIC值。所有检测药物均设置50%生长抑制(MIC50)及100%生长抑制(MIC100)2个判读终点;(4)联合用药效果评价:采用部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index,FICI)判断联合用药两种药物间相互作用的效果。2.舍曲林、盐酸小檗碱联合抗真菌药物对T.asahii生物膜的体外药敏试验:(1)T.asahii临床株的复苏、纯化与菌液制备;(2)在96孔板中构建T.asahii生物膜体外模型;(3)T.asahii生物膜药敏板的制备;(4)T.asahii生物膜最低抑菌浓度(sessile MIC,SMIC)的结果判读:采用XTT还原比色法比较各孔与生长对照孔的OD值变化来计算SMIC值,所有检测药物均设置50%生长抑制(SMIC50)及80%生长抑制(SMIC80)2个判读终点;(5)联合用药效果评价:采用部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index,FICI)判断联合用药两种药物间相互作用的效果。结果:第一部分:人THP-1单核细胞对T.asahii感染的基因表达谱反应1.人THP-1单核细胞与T.asahii体外相互作用后的基因表达谱变化:共筛选出1315个差异表达基因,其中463个基因表达明显上调,852个基因表达明显下调。应用DAVID 6.7进行基因功能注释聚类分析,上调的基因共得到30个GO基因注释聚类和1个KEGG pathway注释聚类,下调的基因共得到33个GO基因注释聚类和1个KEGG pathway注释聚类。生物信息学分析提示上调的差异表达基因主要涉及固有免疫反应、适应性免疫反应、炎症反应、凋亡和抗凋亡等生物学反应。下调的差异表达基因主要涉及细胞周期、有丝分裂、DNA修复等生物学过程。上调幅度最大的基因主要为编码促炎细胞因子及趋化因子的基因。2.Real time PCR验证基因表达谱数据:IL-1β、TNF-α、CCL3、NF-κB1、TLR4及NLRP3在m RNA水平的表达明显上调,CCR2的表达明显下调,Real time PCR与基因表达谱芯片检测同一基因的表达变化趋势一致。3.ELISA法验证基因表达谱数据:人THP-1单核细胞与T.asahii体外相互作用3 h、6 h、9h及12 h后,TNF-α、IL-1β及CCL3的蛋白表达水平均明显高于对照组(P<0.05),与基因表达谱同一基因的表达变化趋势一致。第二部分:粒-巨噬细胞集落刺激因子对人THP-1单核细胞抗T.asahii感染活性的增强作用1.GM-CSF对人THP-1单核细胞吞噬T.asahii的影响:重组人GM-CSF预孵育可使人THP-1单核细胞对T.asahii的吞噬率(相互作用1小时)从20%提高到84%左右。人THP-1单核细胞对T.asahii的吞噬率随重组人GM-CSF浓度(100U/ml、200U/ml及400U/ml)增高而升高,具有浓度依赖性。2.GM-CSF对人THP-1单核细胞杀伤T.asahii功能的影响:200U/ml及400U/ml的重组人GM-CSF预孵育组,每毫升T.asahii菌落形成单位较对照组明显减少(P<0.05)。第三部分:舍曲林、盐酸小檗碱联合抗真菌药物对T.asahii游离细胞及生物膜的体外协同抗菌作用1.舍曲林、盐酸小檗碱联合抗真菌药物对T.asahii游离细胞的体外药敏试验:舍曲林单药对21株T.asahii临床株的MIC50为4-8μg/ml,MIC100为8-32μg/ml。舍曲林与抗真菌药物联合应用可明显降低氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B对T.asahii游离细胞的MIC50及MIC100。舍曲林与氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑及两性霉素B对大部分T.asahii菌株均有明显的协同抗菌作用(FICI≤0.5)。其中与两性霉素B的协同作用最强,90.5%的菌株(19株)观察到舍曲林与两性霉素B联合应用有协同抗菌作用。盐酸小檗碱单药对所有T.asahii菌株的MIC50及MIC100均>128μg/ml。盐酸小檗碱与抗真菌药物联合应用可明显降低氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B对T.asahii游离细胞的MIC50及MIC100。盐酸小檗碱与氟康唑、及两性霉素B对大部分T.asahii菌株均有明显的协同抗菌作用(FICI≤0.5)。其中与两性霉素B的协同作用最强,71.4%的菌株(15株)观察到舍曲林与两性霉素B联合应用有协同抗菌作用。2.舍曲林、盐酸小檗碱联合抗真菌药物对T.asahii生物膜的体外药敏试验:舍曲林单药对T.asahii生物膜显示出明显的抑制作用(SMIC50 16-32μg/ml,SMIC8032-64μg/ml)。舍曲林与抗真菌药物联合应用可明显降低氟康唑、两性霉素B对T.asahii生物膜的SMIC50,但对四种抗真菌药物的SMIC80无明显影响。舍曲林与两性霉素B联合应用对T.asahii生物膜有较明显的协同抑制作用,81%的菌株(17株)观察到舍曲林与两性霉素B联合应用对T.asahii生物膜有协同抑制作用,而舍曲林联合应用三种唑类抗真菌药物对T.asahii生物膜未见明显的协同抑制作用。盐酸小檗碱单药对所有21株T.asahii临床株生物膜均无明显抑制作用(SMIC50及SMIC100均>128μg/ml)。盐酸小檗碱与抗真菌药物联合应用可降低氟康唑、两性霉素B对T.asahii生物膜的SMIC50,但对四种抗真菌药物的SMIC80无明显影响。盐酸小檗碱联合应用三唑类抗真菌药物对T.asahii生物膜未见明显的协同抑制作用。28.6%的菌株(6株)观察到盐酸小檗碱与两性霉素B联合应用对T.asahii生物膜有协同抑制作用,但有协同作用的比例较低,需要扩大样本量以进一步验证两者的协同作用。结论:1.本课题的基因表达谱研究在转录水平上揭示了宿主单核细胞对T.asahii感染的整体反应。人THP-1单核细胞遭遇T.asahii感染,可出现大量抗真菌感染免疫及细胞生物学相关基因的差异表达。其中,表达上调幅度最高的均是编码促炎细胞因子的基因,如TNF-α、IL-1β及CCL3等,提示人THP-1单核细胞可通过上调促炎细胞因子、趋化因子等炎性介质的表达,产生强大的炎症反应,发挥抗T.asahii感染作用。此外,部分适应性免疫反应相关基因的表达明显上调,提示人THP-1单核细胞试图进一步激活适应性免疫反应以增强宿主抗T.asahii感染的能力。2.重组人GM-CSF可明显增强人THP-1单核细胞对T.asahii的吞噬、杀伤活性。应用重组人GM-CSF辅助治疗T.asahii播散性感染是一种可行的治疗策略。3.舍曲林有明显的体外抑制T.asahii游离细胞及生物膜活性。对于应用医疗植入物等有形成T.asahii生物膜风险的重症患者,舍曲林以其明显的抗T.asahii生物膜活性及较小的副作用,显示出很好的临床应用价值。舍曲林及盐酸小檗碱可提高T.asahii对氟康唑、两性霉素B等常用抗真菌药的敏感性,可作为辅助治疗T.asahii播散性感染的新型药物增效剂。4.增强单核细胞免疫防御功能及提高病原真菌对抗真菌药物的敏感性是抗T.asahii播散性感染的有效策略。