【摘 要】
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粉丝是生活中常见的一种淀粉类食品,薯类粉丝因为营养丰富,热量低、且维生素以及赖氨酸含量高受到很多消费者的青睐。但薯类原料中支链淀粉含量较高,不易老化,添加一定量的明矾可以增强老化程度,使制作出的粉丝具有韧劲,不易断条。但摄入过多的明矾会使人体中铝的含量过多,危害人体健康。本课题组在前期的研究中开发了一种以普鲁兰酶代替明矾的粉丝制作工艺,可获得品质良好的薯类粉丝。为了获得更适合于粉丝制作工艺的普鲁兰
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粉丝是生活中常见的一种淀粉类食品,薯类粉丝因为营养丰富,热量低、且维生素以及赖氨酸含量高受到很多消费者的青睐。但薯类原料中支链淀粉含量较高,不易老化,添加一定量的明矾可以增强老化程度,使制作出的粉丝具有韧劲,不易断条。但摄入过多的明矾会使人体中铝的含量过多,危害人体健康。本课题组在前期的研究中开发了一种以普鲁兰酶代替明矾的粉丝制作工艺,可获得品质良好的薯类粉丝。为了获得更适合于粉丝制作工艺的普鲁兰酶,本文将课题组前期工作中得到的具有较高活力的来源于芽孢杆菌的普鲁兰酶基因在不同宿主中进行了表达,研究了重组酶的酶学性质、热稳定性改造及其在粉丝制作中的应用。主要内容如下:（1）克隆枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168菌株的普鲁兰酶编码基因Bs P,分别在大肠杆菌（Escherichia coli）JM109、枯草芽孢杆菌WB600△amy E和枯草芽孢杆菌1A717中进行表达。在大肠杆菌中,重组酶Bs P在胞内累积;在枯草芽孢杆菌WB600△amy E和1A717中,重组酶分泌到胞外。分泌到枯草芽孢杆菌胞外的重组酶Bs Bs P比活力为153.7 U·mg-1,是大肠杆菌胞质内产物的5.5倍。重组酶Bs Bs P最适温度为45℃,最适p H为6.0,在p H 5.0～7.0范围内具有较好稳定性。重组酶Bs Bs P Km值为2.20 mg·m L-1,Vmax值为0.769μmol·m L-1·min-1。重组酶Bs Bs P降解普鲁兰多糖生成单一产物麦芽三糖,对直链淀粉无降解作用,为I型普鲁兰酶,可用于粉丝制作。（2）克隆表达来源于土芽孢杆菌（Geobacillus sp.）XQ6837的普鲁兰酶编码基因Gs P6837,重组酶Gs P6837在E.coli JM109中不同程度地分泌到周质及胞外,胞外、周质分别为198.18 U·m L-1、109.65 U·m L-1,胞内酶活248.27 U·m L-1。在枯草芽孢杆菌WB600△amy E和1A717中Gs P6837胞外酶活分别达到269.48 U·m L-1和317.19 U·m L-1。重组酶Gs P6837比酶活为202.45 U·mg-1,最适温度为65℃,最适p H为6.5,在65℃和70℃下的半衰期分别为4.01 h和7.46 min。Ca2+、Mg2+、K+、Na+、Co2+对Gs P6837活性有促进作用,Cu2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+对Gs P6837酶活力有抑制作用。Gs P6837的kcat为260.76 s-1,Km为5.21 mg·m L-1,重组酶Gs P6837为I型普鲁兰酶,适用于粉丝制作。（3）在半理性设计的基础上对Gs P6837进行热稳定性改造,得到H255G和H255G/S351V/Q87F/Q459K组合突变,Gs P6837野生型Tm值为75.20℃,H255G Tm值为77.54℃,H255G/S351V/Q87F/Q459K组合突变Tm值为78.29℃,Tm值分别提高了2.34℃和3.09℃。H255G和组合突变在70℃下的半衰期分别为22.58 min、23.75 min,是Gs P6837野生型的3.02倍和3.18倍。Gs P6837组合突变的比酶活为222.58 U·mg-1,Km值为4.50,均优于Gs P6837野生型。Gs P6837、H255G和H255G/S351V/Q87F/Q459K组合突变的最适温度都是65℃,圆二色谱分析结果表明H255G、H255G/S351V/Q87F/Q459K组合突变与Gs P6837野生型的二级结构并无差异。（4）在摇瓶水平进行发酵培养基的优化,最适碳源为蔗糖,添加量为20 g·L-1,最适氮源为25.4 g·L-1豆饼粉,无机盐为0.99 g·L-1 Na Cl。优化后Gs P6837CM的酶活最高为439.05 U·m L-1,是初始值的1.76倍;优化后Bs Bs P的酶活最高达35.28 U·m L-1,是初始值的1.5倍。以摇瓶优化后的培养基对重组菌进行5 L发酵罐培养,Gs P6837CM酶活最高为705.75 U·m L-1,是摇瓶水平的1.61倍。Bs P、Gs P6837、Gs P6837CM都可以应用在酶法粉丝工艺中,其中Gs P6837CM可以在70℃的酶反应条件下,制作出质量良好的马铃薯粉丝。
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