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反10,顺12-共轭亚油酸(t10,c12-CLA)是一种具有多种生理功能的十八碳二烯酸,可以由来源于痤疮丙酸杆菌(Propionibactereium acnes)的亚油酸异构酶(PAI)催化亚油酸(LA)产生。本实验室已在重组解脂耶氏酵母内成功实现PAI的异源表达,从而为生物合成t10,c12-CLA开辟了一条新途径。但由于底物LA以及产物t10,c12-CLA作为碳源会参与过氧化物酶体中脂肪酸β氧化途径,使得底物及产物被迅速消耗。因此为了提高t10,c12-CLA单体产量并实现稳定积累,本实验采用基因工程手段分别调控了脂肪酸氧化的代谢途径中三个潜在位点POX2、POX3、PEX10,以期削弱脂肪酸氧化降解并得到一株t10,c12-CLA稳定高产的菌株。研究结果如下:(1)采用Cre-lox系统的方法成功构建了四株β氧化相关基因敲除结合PAI单拷贝的菌株:Polf-Δpox2/1312 opai、Polf-Δpox3/1312 opai、Polf-Δpex10/1312 opai单基因敲除菌株以及Polf-Δpox2Δpox3/1312 opai双基因敲除菌株。(2)基因敲除影响了菌株生长总量以及生长速度。与未敲除菌株比较,四株敲除菌株在YPD培养基达到对数生长期时间均延后了5 h,且PEX10敲除菌体稳定期生物量低于其它菌株。在利用脂类碳源方面,Polf-Δpox2Δpox3/1312 opai,Polf-Δpex10/1312 opai两株菌即可以利用挥发性脂肪酸(VFAs)进行生长又可以稳定脂质积累。在重组菌株稳定期初期添加底物LA,Polf-Δpox2Δpox3/1312 opai、Polf-Δpex10/1312 opai菌株无脂质生物量仅增加2 g/L,说明其利用LA生长能力受到限制。对比四株敲除菌株的t10,c12-CLA降解率,其中Polf-Δpex10/1312 opai最低,为20 mg/L/h,相对于未敲除菌株97.2mg/L/h,显著提高t10,c12-CLA积累的稳定性。因此PEX10敲除菌株对于缓解底物LA降解,稳定CLA产量效果最佳。(3)以Polf-Δpex10为出发菌株,构建了PAI多拷贝整合菌株。并筛选出一株高产t10,c12-CLA的菌株Polf-Δpex10/1292 opai-6,产量为22.3 mg/L。添加红花籽油培养结果显示,t10,c12-CLA总产量提高到7.6 g/L,是单拷贝菌株的2倍。重组菌株t10,c12-CLA降解率为23.0 mg/L/h,相对于未敲除多拷贝菌株的126.3 mg/L/h,敲除菌株显著的稳定了CLA单体产量。(4)在发酵罐水平采用两阶段分批补料策略,葡萄糖耗尽后补料添加VFAs为碳源,并在稳定期初期添加底物红花籽油。结果表明,敲除菌株的无脂质生物量(18 g/L)、t10,c12-CLA最高产量(9.8 g/L),LA转化率(49%),都优于摇瓶培养模式。同时也证明重组菌株可利用VFAs廉价碳源积累生物量,并节约了生产成本。