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研究背景： 骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨细胞减少及关节基质破坏为主要病理特点很常见的退行性病变，骨关节炎严重的患病者可导致关节畸形及功能完全丧失。该病主要发生于中老年人群，是老年患者临床最常见的关节类疾病，流行病学统计结果显示我国40岁以上人群的OA患病率约为30％，65岁以上可达60％～70％。随着我国社会人口老龄化问题的突出，该数据仍继续在不断提升中，已成为越来越备受关注的社会问题。目前，该病尚无明确且有效的根治性的治疗手段，临床上采取的治疗手段主要以控制疼痛、改善关节的功能和提高生活质量为主要目的，首选药物及理疗等保守疗法，当保守治疗无效时，可行关节镜下关节清理、软骨移植和关节置换等外科疗法。新的流行病学证据表明OA的发生与发展除了与年龄直接相关以外，还受到诸多可调节因素的影响，具有可预防和可治疗性。鉴于其病理进程较为复杂，涉及到的机制也具有多样化特征，针对OA的不同病理进程及其相关机制，一些新的治疗方案，如软骨细胞移植术、骨髓间充质干细胞移植术、基质诱导自体软骨细胞移植术等已部分进行了临床开展，并获得了一些效果，但仍不是十分理想。是以更深入研究OA的病理机制，挖掘更为确切的防治靶点，仍然是当前需要解决的一个难题。 长链非编码RNA(Long non coding RNA，Lnc RNA)是非编码RNA的一个亚类，长度超过200nt，较编码RNA具有更强的组织特异性和细胞特异性，在不同细胞、组织及其不同发育阶段，表达均有不同，与多种疾病的发生与发展密切相关。部分学者指出Lnc RNA在OA发病过程中介导重要机制，并通过基因芯片与高通量DNA测序技术发现在软骨分化过程中有2166个Lnc RNA表达上调，1472个Lnc RNA表达下调，为OA的临床治疗提供了新的希望。目前，关于LncRNA在OA的作用已有较多研究，但病理学方面仍然有许多未知之处需深入探索。在既往的前期研究工作中也发现OA患者软骨细胞的LncRNA-UFC1表达水平低于正常软骨细胞。在肿瘤性疾病中，UFC1能通过与miR-34a特异性结合而抑制其活性，解除miR-34a对细胞增殖的抑制作用。miR-34a过表达同时也是OA患者软骨细胞凋亡和再生障碍的一个重要诱因，但在OA中，UFC1是否能够与miR-34a特异性结合，从而促进软骨细胞增殖尚不得知。 本研究分三部分内容，首先观察Lnc-RNA-UFC1对关节炎性海绵状软骨细胞增殖与凋亡行为的影响，分析Lnc-RNA-UFC1在OA病理机制的是否发挥了重要作用，确立其研究价值;其次从Lnc-RNA-UFC1与miR-34a相互调控的角度分析其作用途径，确定Lnc-RNA-UFC1对OA病理机制介导是否是通过miR-34a来完成的;最后选取miR-34a调节OA的相关下游信号分子，对Lnc-RNA-UFC1通过miR-34a促进软骨细胞增殖的机制做初步探讨，最终为完善OA病理机制和探寻新的治疗靶点提供依据。 研究目的： 观察Lnc-RNA-UFC1对关节炎性海绵状软骨细胞增殖与凋亡行为的影响，并从Lnc-RNA-UFC1与miR-34a相互调控的角度分析其作用途径，为完善OA病理机制和探寻新的治疗靶点提供依据。 研究方法： 1.OA软骨细胞的体外培养和样本选取 以30名行人工全膝关节置换术的OA患病者为病理对象取其OA软骨细胞，20例不曾患OA或者RA（类风湿性关节炎）预行全髋关节置换术的股骨颈骨折患者的正常软骨细胞做为对照组，术中留取软骨组织。采用两步酶消化法分离人的软骨细胞，并进行传代培养，取2、3、4代细胞各培养14d，制备生长曲线，并采用免疫组织化学实验测定软骨细胞Ⅱ型胶原的表达情况，选取生长良好、Ⅱ型胶原充足的细胞纳入样本。 2.OA软骨细胞和正常软骨细胞的UFC1表达和行为学特征 纳入实验的OA软骨细胞和正常软骨细胞，采用96孔板培养，37℃，5％CO2培养48h，采用定量实时PCR实验测定UFC1表达水平，采用CCK-8细胞增殖活力实验测定细胞增殖活力，采用Annexin V和PI双染流式细胞实验测定细胞凋亡率，对比各个指标的组间差异。 3.UFC1过表达和沉默对行为学特征的影响 采用siRNA技术分别构建UFC1过表达(UFC1 overexpression)和UFC1干扰慢病毒载体质粒（简称为shRNA1与shRNA2），转染至OA软骨细胞。96孔板培养细胞，设立对照组（Controls1），空载质粒脂质体转染组（Controls2）、UFC1组过表达组(UFC1 over expression)及UFC1沉默组（shRNA1与shRNA2）。Controls1仅含OA软骨细胞、Controls2加入空载质粒和脂质体共培养、UFC1over expression、shRNA1及shRNA2分别加入相应的UFC1-siRNA-脂质体复合物进行共培养，37℃，5％ CO2共培养48h，对比各组细胞细胞增殖活力、细胞凋亡率，继续培养，绘制14d生长曲线。 4.OA软骨细胞中UFC1与miR-34a的相关性考察 纳入实验的OA软骨细胞和正常软骨细胞，37℃，5％ CO2培养48 h，采用定量实时PCR实验测定miR-34a表达水平，分析miR-34a mRNA表达与UFC1mRNA表达的相关性。 5.OA软骨细胞UFC1与miR-34a的相互作用 使用脂质体2000将pcDNA3.1-MS2，pcDNA3.1-MS2-UFC1或者pcDNA3.1-MS2-UFC1-mut和pMS2-GFP细胞进行共转染，37℃，5％ CO2培养48h后，再以EZ-Magna RIPRNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒对细胞使用GFP抗体进行RIP分析。并将原代或者变异全长型UFC1克隆到pmirGLO质粒受体中，以上所有原代与变异的受体携带体和模拟生物体内源miR-34a均被导入细胞中，在37℃，5％ CO2培养48h后，通过双荧光素酶受体分析系统测量荧光素活性。 6.UFC1通过miR-34a调控OA软骨细胞的行为学特征 进行靶向干预实验，96孔板培养细胞，设立对照组（Controls）、UFC1沉默组（shRNA1与shRNA2）、miR-34a抑制剂干预组(miR-34a inhibitor)、UFC1过表达组(UFC1 over expression)和miR-34a干预组(miR-34a); Controls正常培养;shRNA1、shRNA2和miR-34a inhibitor均采用siRNA实验构建UFC1干扰质粒，且miR-34a inhibitor额外添加miR-34a抑制剂;UFC1 over expression和miR-34a均采用siRNA实验构建UFC1过表达质粒，且miR-34a额外添加miR-34a，37℃，5％CO2培养48 h，测定细胞增殖活力、凋亡率及14d生长曲线。 7.UFC1通过miR-34a调控OA软骨细胞的行为学的机制研究 进行靶向干预实验，96孔板培养细胞，设立对空白对照组（Controls1）、空载质粒组（Controls2）、UFC1沉默组(shRNA)、miR-34a抑制剂组(miR-34ainhibitor)。Controls1仅OA软骨细胞;Controls2同时含有OA软骨细胞和空白脂质体质粒;shRNA以siRNA转染实验沉默UFCI（取第一、二部分实验的shRNA1，重新命名为shRNA），miR-34a inhibitor在沉默UFC1的基础上加入miR-34a inhibitor，37℃，5％ CO2，培养72 h分别以荧光定量PCR实验和免疫蛋白印迹(WB)实验测定ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-9、MMP-13的mRNA表达水平及蛋白表达水平。 研究结果： 1.OA软骨细胞的体外培养和样本选取 软骨细胞于培养的第3d左右开始生长，7～10 d生长速率达到顶峰，之后由于进入减速期，第2、3代细胞的生长状况明显优于4代。对各代细胞的Ⅱ型胶原进行免疫组织化学染色实验，2代细胞着色良好;3代细胞着色减弱，但仍见较清晰的阳性细胞;4代细胞着色差，已发生较大程度的变异，故以第2、3代细胞作为主要样本。 2.OA软骨细胞和正常软骨细胞的UFC1表达和行为学特征 OA患者软骨细胞的UFC1 mRNA表达水平明显低于正常软骨细胞，细胞增殖活力低于正常的软骨细胞，细胞凋亡率高于正常的软骨细胞，差异有统计学意义(P＜0.01)。 3.UFC1过表达和基因沉默对行为学特征的影响 UFC1过表达组OA软骨细胞组的UFC1表达量明显高于未转染组（Controls1，P＜0.01），同时，细胞生长速率和增殖活力明显提高，凋亡率降低，与Controls1相比差异有统计学意义（P＜0.01）;shRNA1和shRNA2OA软骨细胞的UFC1表达量明显低于未基因沉默者（Controls1，P＜0.01），同时，细胞生长速率和增殖活力明显降低，凋亡率升高，与Controls1相比差异有统计学意义(P＜0.01)。 4.OA软骨细胞中UFC1与miR-34a的相关性考察 OA患者软骨细胞miR-34a mRNA表达水平明显高于正常软骨细胞(P＜0.05)，进一步分析结果显示，OA患者软骨细胞miR-34a mRNA表达与UFC1 mRNA表达具有负相关性(R2=0.6173，P＜0.05)。 5.OA软骨细胞UFC1与miR-34a的相互作用 RIP法下调UFC1的内源性microRNA水平后，UFCI在软骨组织中的RIP水平与空白组相比miR-34a水平显著增加(MS2)，UFCI在miR-34a作用靶点发生突变(UFCI-mut)。荧光素酶受体分析结果显示miR-34a的过度表达减少了原代受体因子的荧光素酶活性，而不是空载体或者突变受体载体。由AGO2下调的UFC1在miR-34a过度表达的细胞中含量显著增加，且原代UFC1过度表达而并非变异体抑制了miR-34a水平。 6.UFC1通过miR-34a调控OA软骨细胞的行为学特征 与Controls相比，shRNA1和shRNA2OA软骨细胞的生长速率减慢，增殖活力降低，凋亡率升高;给予miR-34a inhibitor后，OA软骨细胞的生长速率增快，增殖活力升高，凋亡率降低;各组间的比较明显存在统计学差异(P＜0.01)。与Controls相比，UFC1 over expression OA软骨细胞的生长速率增快，增殖活力升高，凋亡率降低;经miR-34a干预后，OA软骨细胞的生长速率减低，增殖活力降低，凋亡率升高，组间差异均有统计学意义(P＜0.01)。 7.UFC1通过miR-34a调控OA软骨细胞的行为学的机制研究 与Control1相比，Control2的各个指标水平差异均无统计学意义（P＞0.05）;shRNA的ADAMTS-4 mRNA和蛋白表达水平明显升高，而给予miR-34a抑制剂后(miR-34a inhibitor)明显降低，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）;而同法测定shRNA的ADAMTS-5 mRNA组间均无统计学意义（P＞0.05）;shRNA的MMP-3、MMP-9与MMP-13 mRNA和蛋白表达水平明显升高，而给予miR-34a抑制剂后(miR-34a inhibitor)明显降低，均发现组间的差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论： 1.本研究对OA软骨细胞和正常软骨细胞的LncRNA-UFC1表达情况进行考察，并通过获得性丧失研究LncRNA-UFC1对软骨细胞的行为学的影响，发现LncRNA-UFC1能够促进OA软骨细胞的增殖活性，抑制其凋亡率，促进软骨细胞生长，在OA的病理机制中可能介导重要作用。 2.LncRNA-UFC1对OA病理的调控可能与miR-34a有关，LncRNA-UFC1与miR-34a结合后使其表达沉默，功能受到抑制，从而促进了OA软骨组织的细胞增殖并抑制其细胞凋亡，对该机制的深入研究，有可能会为OA的临床上的诊治提出新的靶点。 3.LncRNA-UFC1与miR-34a结合后，能抑制其下游信号分子ADAMTS-4、MMP-3、MMP-9和MMP-13的表达，从而缓解细胞外基质降解和软骨组织破坏，可能为其抗OA机制的重要构成部分之一。