【摘 要】
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目的:构建Ki67启动子调控表达IL-24的条件增殖腺病毒。
方法:
1.以pGL3-Ki67为模板,设计Ki67启动子的特异性引物,PCR拉出Ki67核心启动子,电泳回收Ki67核心启动子片
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目的:构建Ki67启动子调控表达IL-24的条件增殖腺病毒。
方法:
1.以pGL3-Ki67为模板,设计Ki67启动子的特异性引物,PCR拉出Ki67核心启动子,电泳回收Ki67核心启动子片段,克隆进pZXC2的XhoⅠ/SnaBⅠ位点,构建pZKi67并测序。
2.以pCDNA3.1-IL24为模板,设计IL-24的特异性引物PCR拉出IL-24,BamHⅠ/HindⅢ酶切IL24片段,克隆进pCA13的BamHⅠ/HindⅢ位点,构建pCA13-IL24并测序。将pCA13-IL24用BgLⅡ酶切,得到带有CMV启动子+IL-24+SV40的表达框。将此表达框插入pZD55的BgLⅡ位点,构建pZD55-IL24。PCR、酶切鉴定。
3.用XbaⅠ和EcoRⅤ双酶切pZKi67、pZD55-IL24、pZD55-EGFP,取pZKi67酶切小片段和pZD55-IL24、pZD55-EGFP酶切大片段连接,构建pZKi67-ZD55-IL24、pZKi67-ZD55-EGFP克隆。PCR、酶切鉴定。
4.将pZKi67-ZD55-IL24、pZKi67-ZD55-EGFP分别与腺病毒包装骨架质粒pBHGE3共转染293细胞,9-12天后出现病毒空斑。病毒小量扩增后提取重组腺病毒的DNA,PCR鉴定正确者即为条件增殖腺病毒ZKi67-ZD55-IL24、ZKi67-ZD55-EGFP。
结果:
1.PCR、测序鉴定表明pZKi67构建成功。
2.PCR、测序鉴定pCA13-IL24构建成功。
3.PCR、酶切鉴定pZD55-IL24、pZKi67-ZD55-IL24、pZKJ67-ZD55-EGFP构建成功。
4.PCR鉴定表明病毒ZKi67-ZD55-IL24、ZKi67-ZD55-EGFP包含目的基因,且无野生型腺病毒污染。
结论:成功构建的ZKi67-ZD55-IL24为研究其靶向肾癌治疗奠定了基础。
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