脱氧核酶是具有催化功能的单链DNA分子,于1994年由罗纳德·布瑞克和杰拉尔德·乔伊斯首次报道。目前,已发现脱氧核酶催化类型主要是断裂型和连接型。我们课题组主要研究断裂型脱氧核酶。类手枪脱氧核酶（PL）是由罗纳德·布瑞克实验室筛选获得的一种具有氧化断裂DNA活性的脱氧核酶,该酶活性依赖双辅因子“X/Cu²⁺”,例如维生素C/Cu²⁺或过氧化氢/Cu²⁺。近期我们鉴定出该酶多种新X辅因子,例如维生素B6、辅酶II、谷胱甘肽、邻苯三酚和羟胺等。这些X辅因子种类不同且结构多样,分析其催化机制可能是超氧阴离子介导的DNA氧化断裂反应。2014年,唐卓课题组报道了具有DNA氧化断裂活性的F-8脱氧核酶。我们研究发现F-8与PL可以“共享”大部分X辅因子,推测这两种脱氧核酶催化机制相似。2017年,斯科特·西尔弗曼等人在筛选酰胺键断裂活性脱氧核酶的过程中意外获得了氧化断裂DNA活性的RadDz3脱氧核酶。本论文以RadDz3脱氧核酶为研究对象,设想F-8、PL“共享”X辅因子也适用于RadDz3脱氧核酶并获得实验支持,证实了固态金属也能参与催化反应以及Cu²⁺可以作为酶反应的辅助增强因子,将酶活性依赖的双辅因子“X/Mn²⁺”形式转变为三辅因子“维生素C/Cu²⁺/Mg²⁺(Ba²⁺/Ca²⁺)”形式,同时发现了RadDz3多种类型抑制因子。此外,鉴定了该酶断裂位点、提出了一种基于该酶断裂产物的DNA连接方法并尝试改造催化核心结构。首先,我们对RadDz3脱氧核酶辅因子进行研究。该酶原反应体系包括3种二价金属离子Mn²⁺、Zn²⁺和Mg²⁺。根据F-8脱氧核酶双辅因子“X/Mn²⁺”形式,我们推测Mn²⁺在RadDz3脱氧核酶催化反应中起主要作用。利用维生素C和过氧化氢检测Mn²⁺、Zn²⁺和Mg²⁺作用,数据显示Mn²⁺与维生素C或过氧碳酸钠组合酶活性最佳,Zn²⁺、Mg²⁺与过氧化氢组合有一定作用,Zn²⁺、Mg²⁺与维生素C组合未显示效果,由此反应辅因子组成可以简化为“X/Mn²⁺”形式。通过过氧化氢、过氧碳酸钠以及葡萄糖/葡萄糖氧化酶（后两者在溶液中生成过氧化氢）与Mn²⁺组合效果明确了过氧化氢在断裂催化过程中扮演重要角色。选取维生素C/Mn²⁺组合,在维生素C、Mn²⁺以及NaCl浓度、反应体系pH值、反应温度和时间等方面进行条件优化。在优化反应条件下,检测11种二价金属离子作用,只有Mn²⁺显示出作用。在Mn²⁺存在条件下,以PL脱氧核酶X辅因子为参考检测了维生素类、酚类、胺类、巯基以及荧光类共计26种化合物作用,新发现NADH、荧光素、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、间苯三酚以及羟胺可以作为RadDz3脱氧核酶的X辅因子。邻苯二酚衍生物如多巴胺、绿原酸以及间苯二酚衍生物白藜芦醇也能起到类似作用。根据我们实验室最新研究发现:一些固态金属可以作为PL脱氧核酶的辅因子,我们对24种金属进行检测,在对苯二酚存在条件下发现锰、钴、铌、铟、锡可以促进催化反应,其中铟金属效果最好,而三价铟离子则未显示出作用。我们还发现了Cu²⁺可作为增强因子能有效提高维生素C/Mn²⁺作用,暗示Mn²⁺既可以作为辅因子又能辅助DNA折叠的双重作用。基于此,我们用Cu²⁺替代发挥辅因子作用的Mn²⁺,Mg²⁺、Ba²⁺或Ca²⁺替代Mn²⁺辅助DNA折叠作用,成功构建了维生素C/Cu²⁺/Mg²⁺(Ba²⁺/Ca²⁺)3辅因子形式。随后是RadDz3脱氧核酶抑制因子研究。选择了过氧化氢酶、氮蓝四唑和细胞色素C进行检测,结果显示均可以有效的抑制催化反应,表明反应过程中存在过氧化氢和超氧阴离子参与。在检验Zn²⁺是否可以增强维生素C/Mn²⁺的催化活性的过程中,发现Zn²⁺以及Co²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺均可以抑制酶活性,上述金属离子可以作为RadDz3的抑制因子,而Mg²⁺、Ba²⁺和Ca²⁺则未显示出抑制作用。谷胱甘肽、半胱氨酸、二硫苏糖醇和巯基乙醇是PL脱氧核酶高效的X辅因子,但实验数据却显示这些化合物对RadDz3活性有明显的抑制作用。二价金属离子螯合剂EDTA和1,10-菲啰啉被证实能够有效抑制催化反应,不过1,10-菲啰啉抑制原因可能是竞争超氧阴离子或者结合底物。此外,在对断裂产物鉴定的研究中,利用质谱检测确定了RadDz3断裂后新产生的3’末端带有羧基基团。根据这一结果,我们提出一种羧基-氨基的连接反应,应用于体外筛选变构脱氧核酶实验方案。最后,我们比较RadDz3和PL二级结构,尝试对两种酶的二级结构进行替换,实验结果未检测出断裂活性,表明二者催化核心结构保守,不适合替换改造。通过上述研究,我们扩展和丰富了RadDz3脱氧核酶辅因子和抑制因子种类和数量,探讨了其可能的反应机制,分析了反应体系中Mn²⁺所起到的作用,确定了断裂片段的羧基基团,提出了一种DNA化学连接方法,为后续体外筛选应用奠定了基础。