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目的:慢性肾脏疾病(Chronic kidney disease,CKD)是指各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍。慢性肾脏疾病不但病死率高,同时能够明显增加患者合并心血管疾病的风险,往往维持治疗需要巨额的经济支出。统计数据显示,慢性肾脏病发病率呈逐年增高的趋势,因此它已经成为备受关注的全球性公共健康问题之一。肾间质纤维化是CKD进展成为肾脏衰竭甚至终末期肾衰竭的重要病理表现。在导致肾间质纤维化的众多途径中,肾小管上皮细胞-间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)占据着重要的地位,转化生长因子beta1(Transforming growth factor beta,TGF-β1)被认为是能够导致肾小管EMT的最关键的促纤维化因子之一。而本文研究的Livin/BIRC7最初是在黑色素瘤中被发现,后被归类于凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族。Livin在正常高分化器官中少有表达,但在多种实体肿瘤中参与调控肿瘤的侵袭,转移和对化疗药物的耐药等生物学行为。而近期来相关的研究发现,Livin除了抑制凋亡来发挥效应,也在肿瘤细胞的上皮间质转分化过程中发挥调控作用。本研究使用TGF-β1来诱导人肾小管上皮细胞(HK2细胞)发生EMT,研究Livin在肾小管EMT中的作用及其机制,并且建立大鼠单侧输尿管结扎模型(UUO模型),从体内实验来印证Livin参与了调控EMT的过程。方法:1.动物实验:将雄性SD大鼠随机分为假手术组(sham组)及单侧输尿管梗阻手术组(UUO组),对假手术组大鼠仅游离左肾输尿管,不结扎后直接缝合腹膜及皮肤,对UUO组大鼠进行左肾输尿管结扎后缝合腹膜及皮肤。于术后14天分别为每组8只大鼠留取血液标本,处死后留取肾脏组织进行免疫组织化学染色并用qPCR法检测Livin、E钙粘蛋白(E-Cadherin,E-ca),肌动蛋白α(α-SMA)和波形蛋白(vimentin,vim)的mRNA表达。2.细胞实验:常规培养HK2细胞,用不同浓度的TGF-β1(0,1,2,5,10ng/ml)刺激HK2细胞0,24,48,72小时,用相差显微镜观察细胞形态,结合Western blot结果选择最合适的浓度及刺激时间。对不同分组的细胞,应用Western blot,免疫荧光方法检测Livin,E-cadherin,α-SMA和vimentin的蛋白表达水平,并应用qPCR检测相应指标的mRNA的表达水平,同时应用Transwell小室来检测细胞的迁移能力的变化。根据基因序列,设计靶向沉默Livin的si RNA,检测Livin,E-cadherin,α-SMA和vimentin的表达及细胞迁移能力的变化。应用qPCR技术检测TGF-β1刺激后的HK2细胞中lncRNA-ATB的表达也有所上调,对lncRNA-ATB进一步进行沉默及过表达处理后,检测Livin,E-cadherin,α-SMA和vimentin的表达变化,从而研究Livin在促进肾小管EMT过程的可能的机制。结果:1.UUO模型组大鼠的Scr及BUN均较sham组明显升高。免疫组化染色可见UUO组中α-SMA,vimentin及Livin在肾小管中的表达水平明显上调,而E-cadherin表达下降,sham组中上述蛋白的表达呈较低的水平。qPCR结果也符合蛋白表达趋势。2.应用TGF-β1刺激HK2细胞后,细胞由卵圆形,连接紧密状态变成梭形改变,形态变大、变长,且细胞间间距增加,细胞分布松散。3.TGF-β1刺激EMT的发生具有一定时间依赖性和浓度依赖性。细胞形态上,TGF-β1浓度为2ng/ml、作用48小时时细胞形态即有明显的变化。Western blot及qPCR结果显示在同样作用48小时的情况下,Livin的表达在2ng/ml TGF-β1作用组升高最明显,故而本实验选择TGF-β1的最佳刺激条件为2ng/ml作用48小时。4.TGF-β1作用于HK2细胞,可以明显降低E-ca的蛋白及mRNA表达,升高vimentin和α-SMA的蛋白及mRNA的表达,并且能够使HK2细胞的迁移能力增强。5.Livin的沉默能够减轻TGF-β1对HK2细胞的致EMT作用:与si RNA阴性对照组相比,E-cadherin的表达升高,vimentin和α-SMA的表达降低,细胞的迁移能力减弱。6.LncRNA-ATB的表达随着TGF-β1诱导EMT的发生明显增高。7.沉默lncRNA-ATB可以缓解TGF-β1诱导EMT的程度。8.过表达lncRNA-ATB能够加重EMT程度。9.Livin的沉默能够减少lncRNA的表达,而lncRNA-ATB的过表达或者沉默对Livin的蛋白及mRNA的表达几乎无影响。结论:1.在大鼠UUO模型中,肾间质纤维化的发展过程中有EMT的参与,并且Livin也与纤维化过程相关。2.Livin参与调节TGF-β1诱导的肾小管的EMT过程。3.沉默Livin能够减轻TGF-β1诱导HK2细胞发生EMT的程度。4.Livin可以通过lncRNA-ATB来促进EMT的发展。