研究背景：心脏的正常生理功能受自主神经系统调节,支配心脏的自主神经系统包括交感神经和副交感神经系统,一般来说,副交感神经和交感神经对心脏的作用是拮抗的,交感神经兴奋时,末梢释放的去甲肾上腺素与心肌细胞膜上的肾上腺素能β受体结合,可导致心率加快,房室交界传导加速、心肌收缩力加强。这些作用分别称为正性变时作用、正性变力作用、正性变传导作用；当副交感神经兴奋时,节后神经元末梢释放的递质乙酰胆碱与心肌细胞膜上的M型胆碱能受体结合,可导致心率减慢、房室传导延迟和心肌收缩力减弱,甚至出现房室传导阻滞,这些作用即负性的变时、变传导和变力作用,在正常情况下,它们相互协调,使心脏在生物电和机械运动上实现同步而成为一个“合胞体”,实现心脏正常的泵血功能。许多病理状态则会引起心脏自主神经病变,从而影响心脏的正常功能,糖尿病和心肌梗死是常见的引起心脏自主神经病变的疾病。2015年国际糖尿病联合会(International Diabetes Federation, IDF)在布鲁塞尔举行的世界糖尿病日中公布的数据显示：目前全球有4.15亿糖尿病(diabetes mellitus, DM)成年患者,另外还有3.18亿人存在患糖尿病的风险。目前糖尿病死亡率大于艾滋病、结核病和疟疾死亡率的总和,大约每6秒就有一个糖尿病患者死亡。糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢型疾病。长期高血糖状态,可以引起各种组织,包括心脏、肾、血管、眼以及神经的慢性损伤和功能障碍。在糖尿病导致的组织损伤中,糖尿病心脏自主神经病变(diabetic cardiac autonomic neuropathy, DCAN)是最为隐蔽和严重的并发症之一。临床流行病学研究显示大约三分之一的糖尿病患者并发DCAN,且随病程的延长其发病率呈增加趋势,其伴发的恶性心律失常甚至心源性猝死的发生率也明显增加,严重威胁糖尿病患者的生命。一系列临床研究证实DCAN早期以心脏迷走神经损害为主,另有研究通过核素显像技术证实在合并DCAN的大鼠心脏中存在交感神经分布的不均衡性现象。上述研究提示,糖尿病可导致心脏自主神经损害及支配失衡,这可能与糖尿病患者室性心律失常高发密切相关,但目前尚缺乏DCAN神经损害的特点及确切的解剖学证据方面的研究。本研究第一部分利用组织学和分子生物学技术探讨糖尿病大鼠在不同病程心脏交感和副交感神经的解剖学变化,并进行心脏电生理学方面的研究,以期探讨糖尿病心脏自主神经病变与心律失常的关系。支配心脏的自主神经具有较高的可塑性,在心血管疾病的不同阶段交感神经和迷走神经的活性有所变化。MI后心脏自主神经包括交感神经和胆碱能神经重新分布,以交感神经再生为主,交感神经活性增加的同时迷走神经活性降低,造成心脏自主神经支配的不均衡分布。因此,心梗诱发的心脏自主神经异常会导致交感神经过度兴奋,降低室性心律失常的阈值,出现危及生命的室性心动过速和室颤。心肌梗死后心脏神经再支配分布由神经生长因子(nerve growth factor, NGF)决定,也通过如semaphorin 3A(sema 3A)等化学驱动因子调控。sema 3A是一种分泌型蛋白,调控轴突/树突生长和神经迁移。它触发生长锥塌陷,抑制轴突生长,并在神经生长、心脏和外周血管张力等方面起重要作用。在本研究第二部分中,通过局部心肌内注射慢病毒携带的Sema3A-shRNA和静脉注射重组Sema3A蛋白调节心脏Sema3A的表达来研究Sema3A在梗死心肌中对心脏自主神经分布的调控。我们的数据显示,沉默Sema3A恶化交感神经过度支配,增加心肌肾上腺素水平和室性心律失常易感性。相反,外源性补充Sema3A减轻这些异常,并保护梗死心脏免于室性心律失常发生。DM与冠状动脉粥样硬化心脏病罹患率的增加密切相关,其使冠心病发病率显著提高了至少2-4倍而被认为是冠心病的等效因子等危症。此外,流行病学研究亦显示,DM合并心肌梗死(myocardial infarction, MI)患者的死亡率明显高于非DM患者,其中,室性心律失常(ventricular arrhythmias,VAs)及心源猝死(sudden cardiac death, SCD)是DM合并MI患者最常见、最重要的死亡原因,但其中的具体机制目前仍尚不清楚。我们前期研究发现,糖尿病可导致心脏迷走-交感神经支配失衡及神经支配在空间上的不均衡,这可能是糖尿病心脏自主神经病变导致恶性心律失常事件高发的重要机制。此外,近年一系列研究证明MI后心脏自主神经存在增生、过度增生即神经重构现象,交感神经的过度增生与MI后期VAs和SCD的发生关系密切。但DM基础上合并MI后是否仍存在交感神经重构,以及是否与糖尿病合并心肌梗死患者室性心律失常发生率较高有关少有报道。本研究第三部分设计糖尿病合并心肌梗死的动物模型,观察糖尿病合并心肌梗死后心脏自主神经的变化及其与室性心律失常易发性的关系。第一部分糖尿病大鼠心脏自主神经病变的特点及其对室性心律失常易感性的影响目的：探讨高血糖状态对心脏自主神经损伤的特点及其对心脏电生理的影响,为DCAN的研究提供神经解剖学证据。方法：雄性SD大鼠随机分为2组：糖尿病组(腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ))及对照组(腹腔注射同等体积的生理盐水),造模成功后上述两组再随机分为4组：3个月组(Control-3,n=10；STZ-3,n=12)和6个月组(Control-6, n=12;STZ-6,n=12).成模3个月或6个月后所有成活大鼠分别利用心率变异性评估大鼠的电生理特性,并利用程序性电刺激诱发室性心律失常。利用免疫组化和实时RT-PCR法检测左心室近端和远端胆碱乙酰基转移酶(choline acetyltransferase,ChAT,标记迷走神经)和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH,标记交感神经)阳性神经纤维及其相应的mRNA表达水平。结果：STZ-3组糖尿病大鼠ChAT阳性神经纤维密度及其mRNA均有不同程度减低,尤以心脏远端为著,但TH阳性神经纤维未见明显减少。而STZ-6组大鼠心肌近端及远端ChAT、TH阳性神经纤维均有明显降低。反映交感神经活性的LF/HF比值在糖尿病大鼠中升高,尤其是STZ-6组糖尿病大鼠。同时,STZ-6组糖尿病大鼠心律失常易感性显著升高。结论：糖尿病可导致心脏迷走-交感神经支配失衡及神经支配在空间上的不均衡,这可能是糖尿病心脏自主神经病变导致恶性心律失常事件高发的重要机制。第二部分Semaphorin 3A干预对心肌梗死后心脏自主神经重构及室性心律失常的影响目的：研究心梗大鼠semaphorin 3A (sema 3A)对心脏自主神经的调控和及其对心梗后室性心律失常(Vas)的影响。方法：为了研究sema3A在梗死后心脏中的作用,在梗死心肌灶周分别注射携带Sema3A shRNA的慢病毒(沉默sema3A)及空白病毒,与此同时,静脉注射重组Sema 3A及空白对照(0.9%NaCl溶液)来验证sema 3A的潜在治疗效果。结果：与空白心脏相比,梗死心肌sema3A的水平明显升高。然而,sema 3A沉默导致交感神经过度增生,心肌内去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)水平增高,室性心律失常易感性增加。与此相反,静脉内注射sema3A则减轻交感神经增生,同时改善心脏自主神经功能,并降低室性心律失常的易感性。与相应对照组相比,心脏梗死面积和心功能无明显改变。结论：沉默Sema3A恶化交感神经过度支配,增加心肌肾上腺素水平和室性心律失常易感性,相反,外源性补充sema 3A上调其水平可以改善心电稳定性,减少室性心律失常的发生,改善心肌梗死后的自主神经功能失调。因此,Sema 3A可作为潜在的治疗心脏自主神经异常致心律失常的靶点。第三部分糖尿病兔心肌梗死后心脏交感神经重构及其与室性心律失常关系的研究目的：探讨糖尿病合并心肌梗死心脏交感神经重构的特点及机制,进一步明确糖尿病合并心肌梗死后心脏交感神经重构与室性心律失常的关系。方法：选取40只新西兰兔作为研究对象并随机分为4组：对照组,DM组,MI组,DI (DM合并MI)组。心梗模型成模8周后进行心脏电生理检查留取心肌标本,利用免疫组化检测梗死灶周及左室游离壁心肌组织中酪氨酸羟化酶(TH,标记交感神经)阳性神经纤维表达及分布；实时RT-PCR法检测TH及神经生长因子(nerve growth factor,NGF)相应mRNA表达水平。结果：DI组QTc以及QTcd长于对照组、DM组以及MI组,其室性心律失常易感性也显著高于其他3组。DM组可观察到交感神经失支配现象,表现为TH阳性神经纤维密度降低,MI组TH阳性神经纤维密度显著增加,而DI组TH阳性神经纤维密度介于DM组与MI组之间,但阳性神经纤维在梗死灶周及左室游离壁分布不均衡,相比于其他组更为紊乱。DI组去甲肾上腺素(epinephrine, NE)含量也介于DM组与MI组之间,与TH阳性神经纤维密度趋势相一致。结论：DM可导致心脏交感神经支配受损,DM基础上发生MI后仍可出现心脏交感神经再生,但再生程度降低且再生神经形态及空间分布异常,且这种非均质性神经重构可导致心脏电生理紊乱,这可能是糖尿病合并心肌梗死患者室性心律失常高发的重要机制。