法氏囊是禽类特有的中枢免疫器官,是B细胞分化发育和成熟的场所。法氏囊超滤液(1KDa以下)含有许多生物活性物质,特别是一些小肽不仅对禽类具有免疫调节功能,而且对哺乳动物及人类淋巴细胞也有明显的免疫学及生理学活性。近年来,对法氏囊活性肽的研究虽然取得了一定的进展,但对法氏囊活性肽的认识还有很多空白,关于它们的生物学特性及功能等方面还有很多值得研究的地方。虽然,禽法氏囊在体液免疫中起调节作用,但还对细胞免疫反应的调节膀导效应具有重要的功能。文献所报道的法氏囊小肽如,囊素三肽(Lys-His-Gly-Amide)、法氏囊肽-1(Tyr-Glu—Glu)、法氏囊肽-2(Trp-Thr—Ala-Glu-Glu-Lys—Gln-Leu)及法氏裳七肽(BSP—Ⅱ,TPSGLVY)等,虽然都对B细胞或体液免疫产生影响,但它们各自也有不同的功能。事实上,代谢过程、免疫和神经内分泌系统之间有相互的作用,影响机体的生理动态平衡。因此,虽然从免疫学观点研究法氏囊活性肽,了解其在禽法氏囊中的免疫学特性是必需的,但对法氏囊活性肽的其他功能的研究同样也是很重要的。由于法氏囊重要的免疫调节活性以及法氏囊提取物具有广泛的生物学活性,因此,对法氏囊中新的活性物质的研究具有非常广阔的领域和实际应用的广泛意义,同时,对于深入了解法氏囊的免疫调节机理及其他生理功能具有重要的理论意义。　　 本研究,充分利用当代先进的生物技术及分析手段,从鸡的法氏囊中提取到一种新的活性五肽:法氏囊五肽(Bursopentine,BP5)。通过研究法氏囊五肽联合禽流感灭活疫苗免疫鸡和小鼠来评价其免疫调节活性并对其免疫调节机理进行探讨。另外,通过体外化学模拟的方法以及巨噬细胞氧化应激模型对其抗氧化活性和抗过氧化应激的机理展开了研究。本研究主要从以下几个方面展开:　　 1法氏囊五肽的分离、纯化和鉴定　　 法氏囊是禽类特有的免疫器官,是B细胞分化发育和成熟的场所,其提取物中含有多种活性物质,具有广泛的生物学活性。本试验以鸡法氏囊为原料,通过匀浆、冻融、超滤和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等步骤,分离纯化得到了一种新的活性肽:法氏囊五肽(Bursopentine)。从500 g新鲜的鸡法氏囊组织中纯化到了4.82 mg的法氏囊五肽。经Edman降解法和ESI-Q-TOF-MS质谱分析,获得了完整的法氏囊五肽氨基酸序列:Cys—Lys-Asp-Val-Tyr,并测知其分子量为626.27 Da。　　 2法氏囊五肽在鸡体内的免疫学活性研究　　 为探讨法氏囊五肽的免疫调节活性,6周龄白来航鸡随机分为5组,每组30只。用合成的法氏囊五肽(BP5)和H9N2禽流感灭活病毒(AIV)混合后分别以肌肉接种的方式给鸡进行2次免疫,同时设两组对照组鸡,分别免疫PBS和灭活的H9N2 AIV。最后一次免疫后1周攻毒。然后通过测定血清 HI效价、Th1和 Th2类型细胞因子分泌水平、淋巴细胞增殖来评价BP5对机体免疫功能的影响。同时以攻毒保护力来评价BP5作为分子佐剂的免疫调节作用。实验结果显示,BP5能够显著提高机体的抗原特异性抗体(HI抗体)；显著提高AIV抗原免疫鸡的细胞因子IFN-γ和IL-4的分泌水平；能有效促进AIV抗原免疫鸡的血液淋巴细胞的增殖。鸡攻毒后肺脏病毒含量检测显示,BP5有助于AIV抗原免疫鸡肺脏病毒的清除。以上结果显示BP5通过介导体液和细胞免疫反应,显著提高了鸡的抗原特异性免疫保护作用,证明其具有良好的免疫调节活性。　　 3法氏囊五肽免疫调节机理的研究　　 为了进一步研究法氏囊五肽的免疫调节机理,4-6周龄小鼠随机分为6组,每组30只。用不同剂量合成的法氏囊五肽(BP5)与H9N2禽流感灭活病毒(AIV)混合后分别以肌肉接种的方式给小鼠进行3次免疫,同时设两组对照组小鼠,分别免疫PBS和常规灭活疫苗。实验结果表明,BP5提高了特异性HA抗体(IgG抗体及其亚型IgG1和IgG2a)的水平,增强了Th1型(IL-2和干扰素-γ)和Th2型(IL-4和-10)细胞因子的分泌,促进了脾淋巴细胞亚群CD4+T细胞(CD3+CD4+)、CD8+T细胞(CD3+CD8+)和B细胞的增殖,增强了细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对NIH3T3细胞的杀伤活性。进一步的研究表明,BP5具有直接激活B细胞而间接增加T细胞增殖的活性；而BP5诱导的B淋巴细胞增殖是由BP5本身巯基自氧化生成的活性氧介导的。此外,本试验的数据还表明,BP5通过信号通路PKC,p38 MAPK和NF—κB发挥诱导B淋巴细胞增殖的作用。这项研究显示,BP5或可作为一种新的强效免疫调节剂或免疫增强剂应用于药物或疾病控制。　　 4法氏囊五肽体外抗氧化活性研究　　 为了进一步了解法氏囊五肽的其它生理功能,在体外无细胞系统,对其抗氧化功能进行了研究。由于法氏囊五肽是一种新的含巯基的活性肽,而很多含巯基的物质具有抗氧化作用,故法氏囊五肽在理论上存在抗氧化活性的可能。本研究应用体外化学模拟的方法证明了法氏囊五肽具有较强的抗氧化活性,包括较强的还原能力,很好的金属螯合能力以及极强的清除自由基的活性,包括清除超氧自由基(O2-)和羟自由基(OH)的活性。实验证明,法氏囊五肽是一种天然的抗氧化剂,具有极好的开发应用前景。　　 5法氏囊五肽抗过氧化应激活性及其机理的研究　　 为了进一步验证法氏囊五肽在活细胞中的抗过氧化活性,本实验利用LPS诱导的活细胞过氧化应激模型对此展开了研究。在LPS激活的小鼠腹腔巨噬细胞中,BP5显著地抑制了活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)的产生,降低了脂质过氧化水平以及抑制诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的活性。在活细胞中,BP5显示了良好的抗过氧化活性。为了探讨BP5这种抑制细胞过氧化应激的机制,本试验研究了BP5对细胞自由基清除系统,特别是对谷胱甘肽(GSH)氧化还原循环及抗氧化酶系统进行了研究。实验数据表明,BP5提升了细胞抗氧化还原保护状态,包括提高了细胞GSH含量以及提高了一些重要的酶系统,其中包括谷胱甘肽过氧化酶,谷胱甘肽还原酶,超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等的活性。为了进一步了解BP5这种抑制氧化应激机制的基础,本实验研究了BP5对细胞核转录因子κB(NF-κB)水平的影响。结果显示,BP5保护巨噬细胞免受LPS引起的细胞过氧化应激的机制与BP5下调NF-κB的活性有关。综上所述,BP5在活细胞系统中具有较强的抗氧化能力。随着对其活性的进一步的研究,一方面,它可能在未来是一种具有广泛应用价值的新的机体抗氧化剂；另一方面,将会拓展人们对于法氏囊生物学特性及生理功能的认识范围。