卤醇脱卤酶,是一类存在于微生物降解有机卤化合物代谢途径中的关键酶之一,它不仅可以通过分子内亲核取代机制,催化邻卤醇转化生成环氧化物和卤化氢,还能在一系列亲核试剂N3-、CN-和NO2-等介导下,高效高选择地催化其逆反应-环氧化物的开环反应,可以用来合成光学纯的环氧化物以及β-取代醇等一系列高价值手性药物中间体。因此,该酶具有十分重要的工业应用前景。通过对目前研究较为广泛的三类卤醇脱卤酶进行氨基酸序列同源性比对分析,我们发现来源于放射形土壤农杆菌(Agrobacterium radiobacter AD1)中的卤醇脱卤酶(Hhe C),在其碳末端与另两类卤醇脱卤酶存在着显著的序列特征差异,即前者拥有长于另两类酶约10个氨基酸的碳末端区域。相关研究表明,这段看似冗长的碳末端区域,对卤醇脱卤酶行使催化功能具有十分重要的作用,但对其具体的调控机制还缺乏深入地研究。为了更高效地研究碳末端的具体功能,本论文在迭代式饱和突变策略(Iterative Saturation Mutagenesis,ISM)的基础上,创建了两种多位点快速进化策略。通过运用相关策略,系统地研究和揭示了卤醇脱卤酶碳末端的具体功能以及相应的调控机制。具体研究内容如下:(1)使用定点缺失突变技术,逐一研究卤醇脱卤酶碳末端区域每个氨基酸位点在酶催化反应过程中的作用。对所获得的10个碳末端氨基酸缺失突变体Δ1~Δ10,进行了表达纯化和功能检测。研究发现:碳末端氨基酸的缺失,对卤醇脱卤酶的催化活性有相当显著的负效应,其中缺失突变体Δ7~Δ10几乎完全丧失了催化活性。此外,碳末端氨基酸缺失后,还对酶的热稳定性具有十分显著的负效应。这些结果表明,该碳末端区域对卤醇脱卤酶行使催化功能是必不可少的。(2)使用单点饱和突变技术,系统地研究卤醇脱卤酶碳末端区域每个氨基酸位点在酶催化反应过程中的具体功能及调控机制。通过基于酶催化活性和热稳定性的文库筛选,获得了20个单点优势突变体,并对其进行表达纯化和功能检测。研究发现:碳末端关键氨基酸位点249和252~254发生突变后,对卤醇脱卤酶的催化活性和热稳定性分别具有十分明显地增强作用,证实了碳末端区域对催化活性和热稳定性均具有一定的调控功能。其中,碳末端关键氨基酸位点253和254,被证实能够在不影响卤醇脱卤酶催化活性情形下,独立地调控酶的热稳定性。同源建模分析发现,优势突变体P253D和P253N,在氨基酸位点253和254之间增加了两个氢键,能够较好地稳定整个碳末端区域的构象,使得它们的热稳定性明显改善。相关结果表明:碳末端区域内氨基酸之间的氢键网络,对其维持和调控卤醇脱卤酶的热稳定性有着不可替代的作用。(3)创建高效的多位点快速进化策略,用于后续进一步研究和调控卤醇脱卤酶碳末端功能。首先,在ISM策略的基础上,结合简并密码子设计工具DC-Analyzer,创建了非连续多位点快速进化策略,并成功用于增强卤醇脱卤酶的催化活性实例中。在对5个氨基酸位点的改造研究中,通过筛选约900个单克隆,获得了催化活性较野生型提高9.3倍的高效突变体。但是,该策略用于含有多个连续或者相邻位点的改造研究时,基于DC-Analyzer所设计的引物数目会大大增加。随后,针对DC-Analyzer的应用局限,成功地开发了适用于连读多位点突变重组的简并密码子工具MDC-Analyzer。在此基础上,创建了连续多位点快速进化策略,并成功运用于提高卤醇脱卤酶的催化活性以及热稳定性实例中。在对6个和7个氨基酸位点的改造研究中,通过筛选1,151和384个单克隆,分别获得了高于其模板5.9倍催化活性和2.3倍热失活半衰期的高效突变体。这些结果表明,本论文所创建的快速进化策略,能够高效便捷地用于快速提高生物催化剂的催化特性。(4)运用所创建的快速进化策略,研究卤醇脱卤酶碳末端区域关键氨基酸位点245,249,252,253和254的重组效应,进一步地调控和改善酶的催化活性以及热稳定性。首先,使用非连续多位点快速进化策略,研究碳末端区域关键氨基酸位点245、249和252的重组效应。研究发现,这3个氨基酸位点对酶的催化活性和热稳定性都有相当明显的加和效应,并且筛选获得了高于野生型卤醇脱卤酶5.0倍催化活性以及3.1倍热失活半衰期的高效突变体DL10。随后,运用连续多位点快速进化策略,在DL10的基础上,进一步研究关键氨基酸位点253和254的重组效应。研究发现,这2个氨基酸位点发生突变后,能够在不影响DL10催化活性的前提下,独立地调控酶的热稳定性,并且筛选获得了高于野生型卤醇脱卤酶4.0倍催化活性以及17.8倍热失活半衰期的高效突变体PX14。可见,碳末端氨基酸调控卤醇脱卤酶的催化活性和热稳定性具有可叠加性。综上所述,本论文选取来源于放射形土壤农杆菌中的卤醇脱卤酶碳末端作为研究模型,系统地研究了该碳末端区域在卤醇脱卤酶行使催化反应过程中的具体功能,揭示了其对酶的催化活性以及热稳定性的调控机制。运用所创建的多位点快速进化策略,成功地筛选获得了多个催化活性和热稳定性得以同时增强的高效突变体,这将有助于推动卤醇脱卤酶的理论研究和实际工业生产应用。