研究背景:孤独症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder,ASD)是复杂的神经发育障碍性疾病,具有高度的病因和临床异质性,其特征是儿童早期的社会交流障碍、刻板重复行为及狭隘兴趣。近年来,世界各国报道的ASD发病率呈急剧上升的趋势,2018年美国疾病控制与预防中心的调查结果显示已达1/59,超过儿童癌症、糖尿病及艾滋病三者的总和。ASD的高发病率及致残率给个人、家庭和社会造成巨大的经济和社会负担,已经成为危害严重的全球公共卫生问题。但至今ASD病因未明,尚无有效和针对性的治疗和干预方法。过去十年,ASD的研究主要集中在遗传基因方面,流行病学调查结果显示遗传因素在ASD的发病中起到非常重要的作用,但遗传病的发病率是相对稳定的,ASD出现的这样一个快速上升的现象,单靠遗传学分析并不能解释其根本原因,也并不符合遗传病发病的规律。针对ASD病因学的研究,目前主要认为遗传和环境因素相互作用,共同在ASD的发生发展中发挥作用。肠道菌群被称为“第二基因组”,随着肠道菌群与ASD研究的不断深入及近年来菌群测序技术的发展,越来越多的研究发现ASD儿童存在胃肠道疾病及肠道菌群紊乱。肠道菌群通过神经系统、内分泌系统及免疫系统影响大脑发育及功能,它们之间相互作用构成微生物-肠-脑轴,微生物-肠-脑轴失衡可影响人类的认知和行为,导致ASD。近年来多项研究发现,胎儿期很多因素可触发母亲一系列免疫反应,这些免疫反应可能增加ASD的患病风险。产前和孕期的多种影响因素都有可能影响孩子的神经系统发育,如产前免疫应激、怀孕期肥胖、精神紧张、各种胃肠道症状等围产期和产后健康状况等都将增加幼儿患ASD等神经障碍性疾病的风险。大量动物实验表明,孕期母亲肠道菌群变化与子代ASD的发生发展相关。改变肠道菌群并进行菌群重构,已被证明可以逆转母体因素导致的后代社交缺陷,且对小鼠和人类的ASD行为都有有益的影响。儿童肠道菌群紊乱引起ASD的研究屡见不鲜,但目前缺少ASD儿童的母子肠道菌群相关性的研究。为数不多的流行病学和动物实验研究不足以支持母亲肠道菌群紊乱与后代神经发育障碍相关。因此尚不清楚ASD儿童肠道菌群与母亲肠道菌群的相关性及菌群结构特点。而且ASD儿童肠道菌群与其母亲及健康儿童相比,其独特的细菌标志物尚未被发现。研究目的:探索ASD母子肠道菌群多样性及菌群结构特点;筛选与ASD临床指标相关的独特的细菌生物标志物;探讨利用肠道菌群独特的细菌生物标志物对ASD儿童的早期筛查与诊断作用。研究方法:实验对象为2016年07月至2017年02月于山东大学齐鲁儿童医院儿童保健所确诊、儿童保健所孤独症康复训练中心(济南市特殊幼儿园)康复训练的ASD儿童及其母亲。健康对照组为山东大学齐鲁儿童医院健康医护人员及其子女。选取符合入组标准的89对母子收取粪便样本,其中59对ASD母子和30对匹配的健康母子。采集研究对象临床信息,其中ASD儿童平均年龄4岁(2-7岁),匹配健康儿童平均年龄5岁(2-10岁);ASD儿童母亲平均年龄33岁(26-38岁),健康儿童母亲平均年龄31岁(27-42岁)。16S rRNA基因V1-V2区扩增子测序用来测定ASD母子及健康母子的肠道菌群,用线性判别分析效应大小(Linear discriminant analysis and Effect Size,LEfSe)分析 ASD 儿童肠道菌群潜在的细菌生物标志物,R package e1071支持向量机分类器对选择的细菌生物标志物进行分类分析,使用ROCR R包计算受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristics,ROC)和曲线下面积(Area under the curve,AUC),并且评估细菌生物标志物在ASD临床诊断中的价值。本研究中,ASD儿童(ASD-C)与健康儿童(H-C)匹配、ASD儿童母亲(ASD-M)与健康儿童母亲(H-M)匹配、ASD儿童母子(ASD-M+C)与健康儿童母子(H-M+C)匹配开展相关研究。研究结果:本研究展示了 ASD-C的肠道菌群结构特征。通过Alpha多样性分析(α多样性分析),我们发现ASD-C肠道菌群细菌丰度显著增加(P<0.01),但ASD-C的肠道菌群的多样性与H-C差异不显著(P=0.13)。根据可操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)的分类,我们发现厚壁菌门/拟杆菌门(Firmicutes/Bacteroidetes)在门级水平无显著差异(P>0.05),但属级水平发现变形菌门(Proteobacteria)在ASD-C的肠道菌群中的含量较高,与H-C相比具有显著差异(P<0.01)。Beta多样性分析(β多样性分析)显示ASD-C与H-C的肠道菌群表现出了明显的聚类,揭示了 ASD-C与H-C的肠道菌群具有显著的差异性(ANOSIM,r=0.197,P<0.01)。LEfSe分析ASD-C肠道菌群的特征微生物群谱和主要的细菌生物标志物,结果显示ASD-C肠道中显著增加的菌属:产碱菌科(Alcaligenaceae)、栖水菌属(Enhydrobacter)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、嗜硒微生物(Wautersiella)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、Parabacteroides 及约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)。同时发现了 ASD-C肠道内丰度降低的菌属:普氏菌属(Prevotella)。分析ASD-M与H-M的肠道菌群结构特征,发现二者肠道菌群群落结构也存在差异。α多样性分析显示,ASD-M肠道菌群细菌丰度显著上升(P<0.05),但两组间肠道菌群多样性无显著差异(P=0.35)。接着我们对门级和属级OTU分类进行对比,发现两组肠道菌群细菌丰度均差异显著。β多样性分析显示两组肠道菌群表现出了明显的聚类,揭示了 ASD-M与H-M的肠道菌群具有显著的差异性(ANOSIM,r=0.248,P<0.01)。LEfSe 分析显示莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(科)和不动杆菌属(Acinetobacter)(属)在ASD-M的肠道内显著增加,而粪杆菌属(Faecalibacterium)显著降低。我们进一步分析ASD-M+C与H-M+C肠道菌群的结构特征。a多样性分析显示,基于PD_whole_tree指数所做的箱线图数值相近,秩和检验(Wilcoxon ranksum tests)表明两组间肠道菌群多样性存在显著差异(P<0.01)。ACE指数(Abundance-based coverage estimator indexes)进一步证实上述结果。β多样性分析显示ASD-M+C与H-M+C的肠道菌群差异有显著的统计学意义(ANOSIM,r=0.191,P<0.01)。随后,我们使用筛选的细菌生物标志物评估两组肠道菌群的相关性,结果显示两组间儿童及母亲肠道菌群表现出明显聚类。本研究进一步分析了 ASD-C与ASD-M肠道菌群的差异,发现产碱菌科(Alcaligenaceae)、梭菌属(Clostridium)、嗜血杆菌(Haemophilus)、Wautersiella仅在ASD-C的肠道相对丰度升高,然而普氏菌属(Prevotella)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)仅在ASD-C肠道菌群中丰度降低。接着,我们使用韦恩图对不同分组之间相同以及存在差异的OTU进行了分析,OTU分类结果显示,ASD-M+C与H-M+C相比,肠道菌群结构特征显著不同。结果显示费氏刺骨鱼菌(Epulopiscium)、鞘脂菌属(Sphingobium xenophagum)、厌氧原体属(Anaeroplasma)、Adlercreutzia、Solirubrobacterales、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、嗜氢菌属(Hydrogenophilus)、盐水球菌属(Salinicoccus)及原孢子科(Promicromonosporaceae)仅在ASD-C肠道菌群中发现。拟杆菌属(Bacteroides ovatus)、乏养菌属(Abiotrophia)在H-M+C组肠道菌群中发现。由于ASD-C和H-C的肠道菌群具有显著的差异,我们进一步寻找可以区分两者的细菌生物标志物。根据严格的筛选标准:P值<0.1且LEfSe分析中LDA值>3,筛选出了 96个显著差异的OTUs。筛选的生物标志物可用来预测ASD疾病的发生风险。ASD-C及H-C两组间发现了 5个细菌生物标志物:β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、莫拉菌科(Moraxellaceae)及鲁氏不动杆菌属(Acinetobacter)。ASD-M与H-M两组间发现6个细菌生物标志物:黄杆菌科(Flavobacteriia)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、周蕨科(Weksellaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)及肠杆菌目(Enterobacteriales)。为了进一步探索这些细菌生物标志物在ASD-C及H-C水平、ASD-M及H-M水平的潜在价值,根据生物标志物,我们构建了 ROC曲线并计算AUC值,对于ASD-C及H-C,AUC值高达0.944(4倍,95%置信区间(CI):84%-100%),敏感性为83.33%,特异性为91.67%。对于ASD-M及H-M,AUC值高达0.986(4倍和5倍,95%CI:94%-100%),具有100%的敏感性和100%的特异性。进一步评估发现年龄、性别和胃肠道症状对ASD-C和H-C的5个候选生物标志物、ASD-M和H-M的6个候选生物标志物均没有显著影响。研究结论:1.孤独症儿童的肠道菌群与健康儿童相比有显著差异,且存在潜在致病菌;2.孤独症儿童母亲与健康儿童母亲的肠道菌群群落结构也存在显著的差异;3.孤独症儿童与其母亲的肠道微生物群谱之间存在明显的相关性;4.孤独症儿童肠道菌群有独特的细菌生物标志物;5.所发现的细菌生物标志物具有潜在的孤独症风险评估价值。