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目的 细小病毒B19(Human Parvovirus B19,以下简称B19),是已知的细小病毒属中唯一致人疾病的病毒。这一病毒广泛存在,在我国也有较高的感染率。主要通过呼吸道、血液制品和宫内传播。由于宿主的免疫力和血液学的状态不同,导致截然不同的临床表现:在健康儿童,导致无害的出疹性疾病,即感染性红斑;在成人,与一种急性多发性关节病有关;对于有潜在血液系统紊乱者,可诱发一过性的再障危象;对于免疫力抑制者,持续的病毒感染表现为再生障碍性贫血或慢性贫血;胎儿由于免疫力未成熟,更易感染B19,发生死胎、胎儿水肿和先天性贫血。B19病毒编码两个结构蛋白(VP1和VP2)及一个主要的非结构蛋白(NS1)。NS1有一个高度保守的核苷三磷酸结合构象,它对于一系列的生物学功能的发挥至关重要,在这一结构域中发生一个氨基酸突变时,NS1的细胞毒性即丧失,提示NS1与核苷三磷酸的结合在B19诱导的细胞凋亡过程中发挥重要的作用。NS1能提供 第·军巨上膏硕士膏位公上DNA结合位点,具有 Ah酶活性、核酸结合和翻译启动子功能。NS蛋白具有细胞毒性,能诱导细胞调亡。它的基因变异与病毒的致病力密切相关。NS蛋白的细胞毒性与 caspase3通路诱发的细胞调亡密切相关。这一通路的激活在 NSI蛋白诱导的细胞凋亡中发挥重要的作用。而特异性 NS蛋白抗体可能与疾病的转归有关。Von Poblotzki等于 1995年成功构建了 NS蛋白大肠杆菌表达系统,Hicks等于 1996年构建了 NS蛋白的杆状病毒 Hela细胞表达系统,这对于进一步研究 NSI蛋白的分于生物学活性提供了可能。研究的目的:扩增人细小病毒B19非结构蛋白Inysl)全长基因,构建克隆载体及原核表达载体,诱导表达 NSI融合蛋白。 方法利用聚合酶链反应(PCR)和分子克隆技术,从我科保存的 BIg阳性标本 XA20中扩增 NS蛋白基因全长,构建 NS IPGtu1七asy克隆载体,序列经测序分析证实正确后亚克隆于pQE30表达载体中,并转化至M15感受态菌中,经IPTG诱导可表达77kD的融合蛋白。 结果*)扩增产物的测序结果与国外标准株(AU株)对比,有一处发生突变,第2439位碱基由T突变为C,氨基酸由精氨酸变为甲硫氨酸/2)构建了克隆载体NSI中GEM1七asy及原核表达载体 NSlpQE30,经酶切鉴定,证实载体构建成功。刀表达的NSI融合蛋白经 10%SDSPAGE电泳证实为77kD。 结论 *)建立了NSI-pQE30原核表达系统。NSI蛋白能在大肠杆菌中稳定表达,其条件是:阳性克隆菌增菌2~3 /J\时后,IPTG浓度 lmml/L,于 25”C诱导 3小时以上。(2在国内首次获得人细小病毒 B19 NSI蛋白融合表达产物,对进一步研究NSI蛋白的生物学活性及其单克隆抗体的制备有重要的意义。