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神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是一种颅外恶性实体肿瘤,在儿童中最为常见,又成为“儿童癌症之王”。它起源于外周交感神经系统,是由发育中的脊髓外层迁移过来的神经母细胞或原始神经嵴细胞衍化而来的,占儿童癌症死亡总数的10%左右。在临床表现上,由于患者年龄大小、肿瘤发生部位、所处范围以及生物学特征的不同,NB的临床表现也是多种多样,因此对患者的预后也有很大差异。目前NB的治疗方法主要包括单纯观察、手术治疗、放射治疗、化学治疗以及生物治疗等,根据患者所处的高、中、低风险分组的不同,治疗强度也有所区别。尽管近年来随着早期诊断技术的不断的发展,NB患者的生存率也在显著升高,但是高风险组患者的5年生存率依然很低。目前,化学治疗在神经母细胞瘤的治疗中仍然扮演着重要角色,由于化疗给病人带来的痛苦和副作用比较严重等原因,因而使寻找新型的高效低毒药物成了目前迫在眉睫的任务。葫芦素B是从葫芦科植物中分离出来的一种四环三萜化合物,具有多种药理学作用,如抗病毒、抗炎及抗癌等活性。由于其具有显著的抗炎活性,因此在传统的使用上主要用于慢性肝炎的治疗。最受广泛关注的是葫芦素B的抗癌活性,它在多种肿瘤细胞中能通过不同的分子作用机制抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,成为潜在的抗癌药物。目前关于葫芦素B对神经母细胞瘤的作用还未知,更没有其对该肿瘤细胞作用机理方面的研究。因此,本文以体外培养的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为材料,首先对葫芦素B对该细胞的抑制作用进行检测,并在此基础上对葫芦素B抑制神经母细胞瘤的分子作用机制进行系统的研究。主要研究结果如下：1)葫芦素B能通过诱导细胞周期阻滞在G2/M期而抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的增殖。采用MTT法检测了葫芦素B对SH-SY5Y细胞增殖的影响,结果显示,葫芦素B能浓度和时间依赖性的抑(?)SH-SY5Y细胞的增殖；PI单染后使用流式细胞仪检测了葫芦素B处理24h后细胞周期分布的变化,发现随着药物处理浓度的增加,处于G2/M期细胞数目积累,细胞周期出现G2/M期阻滞。2)葫芦素B能诱导SH-SY5Y细胞凋亡,促进细胞内ROS产生、线粒体膜去极化和细胞内Ca2+浓度上升。采用Annexin V-FITC/PI双染法检测了葫芦素B对SH-SY5Y细胞凋亡的影响,结果表明,葫芦素B能够浓度依赖性的诱导细胞早期凋亡；使用倒置光学显微镜和Hoechst33258染色后荧光显微镜观察结果显示,经过葫芦素B处理前后细胞发生凋亡的形态学变化；DCFH-DA探针、JC-1荧光探针和Fluo-3AM荧光探针分别检测了葫芦素B处理前后细胞内ROS、线粒体膜电位以及Ca2+等生理水平的变化,结果显示,葫芦素B处理后ROS出现积累,线粒体膜电位下降,胞浆内钙离子浓度上升,且均呈现药物浓度依赖性。3)葫芦素B通过调控与G2/M期运转相关的蛋白及与凋亡相关的Bcl-2家族蛋白的表达水平来诱导SH-SY5Y细胞周期阻滞和凋亡,同时还能浓度依赖性的上调p53和p21的表达以及下调与肿瘤血管生成和细胞转移侵袭相关蛋白的表达。采用RT-PCR和Western blot技术检测了葫芦素B处理24h后,与细胞G2/M期运转和凋亡的相关基因及蛋白表达的变化,结果显示,葫芦素B能够浓度依赖性的抑制Cyclin B1、CDK1和Bcl-2的转录与翻译水平,而上调凋亡蛋白Bax的转录和翻译水平。此外,还检测了葫芦素B对caspase-3和9的活性以及p53和p21蛋白表达的影响,结果表明,葫芦素B也能浓度依赖性的活化caspase-3和9,并促进p53和p21的表达。同时Western blot结果显示,葫芦素B还能抑制与血管生成相关的VEGF蛋白、与细胞转移侵袭相关的MMP-2, MMP-9和COX-2蛋白的表达。4)葫芦素B通过抑制JAK2/STAT3信号通路相关蛋白的表达来抑制SH-SY5Y细胞增殖和诱导细胞凋亡。JAK2/STAT3信号通路在细胞增殖、分化、迁移和凋亡中起着重要作用。因此,我们首先通过Western blot法检测了葫芦素B处理24h后该信号通路相关蛋白表达的变化。结果显示,葫芦素B能浓度依赖性的抑制p-JAK2和p-STAT3的表达,而本底的JAK2和STAT3则没有明显的变化。使用该信号通路的抑制剂AG490和激活剂IL-6检测了蛋白的变化,结果进一步证明了葫芦素B能显著抑制该信号通路的激活。为了检测该信号通路与细胞增殖和凋亡的关系,采用了MTT和流式细胞仪检测了葫芦素B和抑制剂、激活剂处理后细胞增殖率和凋亡率的变化,结果进一步验证了葫芦素B能够通过抑制JAK2/STAT3信号通路的激活来抑制SH-SY5Y细胞增殖和凋亡。5)MAPKs信号通路也参与调控葫芦素B诱导的SH-SY5Y细胞增殖抑制和凋亡。MAPKs在细胞的生长增殖和分化与凋亡中也扮演重要角色。因此,通过Western blot法检测葫芦素B对该信号通路蛋白的影响,结果显示,葫芦素B能浓度依赖性的抑制ERK的激活,同时促进JNK和p38MAPK的激活。通过使用以上三种蛋白的抑制剂PD98059、SP600125和SB203580检测蛋白表达变化,进一步证明葫芦素B能诱导该信号通路的激活。MTT和流式细胞仪检测了该信号通路与葫芦素B诱导的SH-SY5Y细胞增殖抑制和凋亡的关系,结果表明MAPKs信号通路确实参与了葫芦素B抑制SH-SY5Y细胞增殖和诱导凋亡的过程。综上所述,本文的研究结果表明,葫芦素B能够在体外抑制SH-SY5Y细胞增殖和诱导细胞凋亡