缺血性卒中已成为世界各地长期神经功能障碍和死亡的主要原因,约占所有卒中的80%。尽管已经有几十年的深入研究,但能够针对性地治疗缺血性卒中的措施仍然有限。脑缺血的主要致病机制包含谷氨酸介导的兴奋性毒性,钙超载,炎症反应,血脑屏障破坏和氧化应激等。这些病理因素或者环节相互影响,互为因果,进而引起神经细胞凋亡与坏死,最终导致卒中后认知功能障碍。广泛认为半暗带中的细胞凋亡是可逆的过程。细胞凋亡的调控,在保护神经元和改善认知的过程中发挥着重要的作用。因此,探讨神经细胞凋亡的分子机制,寻找有效的治疗方法减少脑损伤,已成为脑血管研究领域的重点和热点。丝切蛋白(Cofilin)是肌动蛋白结合蛋白,受LIMK介导的磷酸化而失活。过量谷氨酸,ATP耗竭或氧化应激处理原代培养神经元,均发现Cofilinrod结构的形成。产生这种棒状结构的神经元在突触结构、突触转运和长时程突触可塑性上都受到了一定程度损伤。Rod的形成主要是由于去磷酸化的Cofilin含量增加引起的,并且仅去磷酸化的Cofilin牵涉线粒体转位。Cofilin线粒体转位在细胞凋亡程序的启动中起到关键作用。此外,引起Rod形成的病理性刺激,均是缺血性卒中的重要病理机制。由此提示,Cofilin及其介导的Rod结构与学习记忆等认知功能密切相关,同时参与缺血性卒中细胞凋亡过程中。目前,电针疗法已成为脑卒中后康复治疗的一种常见方法。督脉经穴"百会"和"神庭"具有益气升阳、填髓充脑、醒脑开窍之功效,常被用于治疗神经和精神疾病,如中风,头痛和头晕等。临床和基础研究均显示,电针"百会"和"神庭"穴有利于保护卒中患者和动物模型的缺血性损伤。本课题组的临床研究显示,针刺"百会"、"神庭"穴在认知康复训练基础上可显著提高脑卒中患者MMSE、MoCA和FIM等认知相关量表的评分。同时,我们以往实验也发现电针"百会"、"神庭"穴能够通过减少脑缺血损伤大鼠的神经细胞凋亡,显著改善其认知功能障碍。然而,电针治疗缺血性卒中的分子机制尚不明确。目的:(1)阐明Cofilin在缺血性卒中后细胞凋亡中的潜在调控作用,为将Cofilin作为脑卒中新的治疗靶点提供实验依据;(2)探讨电针"百会"、"神庭"穴促进脑缺血大鼠认知功能恢复的可能分子机制,为中医康复临床实践提供一定的理论依据。方法:第一部分Cofilin在脑缺血大鼠皮质梗死区细胞凋亡中的作用(1)本研究利用ATP耗竭诱导原代海马神经元,建立体外缺血/缺氧损伤模型,明确Cofilin rod形成和细胞凋亡。(2)同时,以大脑中动脉闭塞法制备缺血性卒中的实验动物模型,通过TTC和NeuN染色来评估MCAO大鼠脑梗死的发展阶段。(3)应用免疫组化和TUNEL染色,观察不同时间点(2h,8h,24h和7d)MCAO大鼠脑皮质梗死区Cofilin rod生成和神经细胞凋亡的情况。(4)为进一步证实去磷酸化Cofilin在脑缺血中的作用,我们利用Limk1过表达抑制Cofilin的活化,观察MCAO大鼠缺血半暗带病毒感染区域Rod形成和Cofilin介导细胞凋亡的情况。第二部分电针"百会"、"神庭"穴调控Cofilin线粒体转位减少皮质缺血区细胞凋亡的机制研究(1)分别于脑缺血术后5min和6h,对MCAO大鼠进行电针干预"百会"、"神庭"穴。(2)通过条件恐惧记忆以及神经功能缺损得分和脑梗死体积,评价电针"百会"、"神庭"对脑缺血大鼠的神经保护作用。(3)采用Nissl染色和荧光染色以观察脑缺血组织损伤、Cofilin rod形成、细胞凋亡和神经元丢失情况。(4)并通过Western blot检测缺血半暗带Caspase-3的活性,及其胞浆和线粒体中Cofilin和p-cofilin的表达水平。结果:第一部分(1)ATP耗竭可诱导原代海马神经元Cofilin rod形成以及细胞凋亡。(2)TTC和NeuN染色显示梗死体积从2h增加到24h,然后在MCAO后24h到7d稳定。(3)Rod结构在梗死核心区2h和半暗带8h开始生成,24h达到峰值,然后在MCAO后7d减少。而逐步增多的Rod结构可能会逐渐诱导脑卒中后梗死皮层MAP2降解和细胞凋亡。(4)Limk1过表达抑制Cofilin的活化,可显著降低MCAO大鼠缺血区半暗带Rod的形成和MAP2降解,并减少Cofilin介导的细胞凋亡,进一步证实了Cofilin在脑缺血中的作用。第二部分(1)急性期电针"百会"、"神庭"穴治疗MCAO大鼠可以显著减小脑梗死体积,并改善脑损伤引起的神经功能缺损症状和认知功能障碍。(2)Western blot分析表明,电针这两个穴位还可以明显抑制Cofilin的线粒体转位和Caspase-3切割。(3)此外,免疫荧光双标结果提示,电针"百会"、"神庭"穴治疗不仅可以部分抑制Cofilin rod形成和MAP2降解,而且还显著减少缺血性卒中诱导的脑组织损伤、细胞凋亡和神经元丢失。结论:(1)体内和体外缺血可诱导Cofilin rod形成和神经元细胞凋亡,而Limk1过表达抑制Cofilin过度激活,可显著减少脑缺血后皮质半暗带Rod形成、MAP2降解和Cofilin线粒体转位介导的细胞凋亡,由此可知,Cofilin对缺血性卒中后Rod形成和细胞凋亡具有重要作用,可作为缺血性卒中潜在的治疗靶点。(2)急性期电针"百会"、"神庭"穴可减少Cofilin rod形成和MAP2降解,抑制Cofilin的线粒体转位,减轻缺血性卒中的脑损伤和细胞凋亡,从而促进认知功能恢复,这可能是电针疗法的新机制。