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自2010年以来,新发鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus,DTMUV)病在我国广泛流行,给我国的养鸭业造成了巨大的经济损失。本研究拟利用弱毒疫苗株(FX2010-180P)建立的反向遗传操作系统,探索在该致弱毒株基因组的不同位置插入报告基因,找到一处能够表达外源蛋白的插入位点,为以后新型疫苗的研发奠定基础。为了探究DTMUV是否能够稳定表达外源蛋白,利用融合PCR等方法,在DTMUV基因组的5’非编码区(UTR)与C基因、C基因与PrM基因、PrM基因与E基因、E基因与NS1基因之间分别插入绿色荧光蛋白基因(EGFP),并在基因之间插入表达口蹄疫2A蛋白的序列;在NS5基因与3’UTR之间插入内部核糖体引入位点(IRES)与EGFP,进而获得5’端含有启动子、外源基因序列的FX2010-180P株全长cDNA。然后以此为模板进行体外转录,得到具有感染性的RNA,将其转染至DF-1细胞4d后,只有NS5基因与3’UTR之间插入外源基因的转染孔出现了表达绿色荧光蛋白的重组DTMUV。将重组病毒连续传代,发现随着传代次数的增加荧光强度逐渐减弱,传至P5代荧光完全消失。测序结果显示,重组病毒不仅丢失了IRES 3’端506个核苷酸以及整个EGFP,而且还丢失了FX2010-180P株3’端紧挨着终止密码子的67个核苷酸。鉴于此,我们人为缺失这67个核苷酸,同时插入IRES与EGFP,同样方法进行重组病毒拯救,发现病毒能够增殖并且产生与亲代毒相似的细胞病变,传至第5代后荧光逐渐减弱,P7代后荧光完全消失,说明缺失这67个核苷酸的重组病毒依旧不能稳定表达外源蛋白。通过高通量测序发现,P2代重组病毒中至少含有12种不同长度序列缺失的病毒,缺失位置也不一致,每个位置丢失序列的长度也不尽相同。继续传代后发现细胞上清中重组病毒种类逐渐减少,最后以一种或者几种比较优势的状态存在。本研究证明在NS5基因与3’UTR之间虽然能够插入并表达外源基因,但是传代后不稳定;本研究获得一系列序列缺失病毒,为研究黄病毒基因稳定性的分子机制提供了素材,为构建稳定表达外源基因的病毒载体奠定了基础。