家蝇蛹天然抗菌肽的制备及其分离纯化研究

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家蝇作为一种重要的资源昆虫,长期以来仅被作为一种物美价廉的饲料蛋白来使用,对其其它价值未作深入的研究及开发。研究表明家蝇抗菌肽具有广谱的抗菌、抗病毒、抗癌和抗原生虫等功效,但目前家蝇抗菌肽制备工艺多处于实验探索阶段,且提取工艺抗菌肽得率较低(低于1%),难于进行大规模生产及制备。本研究以家蝇蛹为材料,利用酸过夜提取-热处理-过滤-超滤-喷雾干燥等工艺制备家蝇抗菌肽。结果表明该制备工艺简便快速,且制备的抗菌肽得率较高,接近1.3%,是已报道的家蝇抗菌肽提取工艺的5倍左右,抗菌活力回收率高达80%。制备的家蝇抗菌肽分子量小于20kDa,主要是一些分子量小于14.4kDa的小分子肽类。产品为淡黄色粉末状,对多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌均具有较强的抑菌活性,对小鼠红细胞无溶血性,能耐受100℃30分钟的加热,在较广泛的pH(2-12)条件下仍具有抗菌活性,4℃存放60天,仍具有90%以上的抗菌活力,稳定性较好。工艺的副产物可用作饲料昆虫蛋白。制备的抗菌肽可用于果蔬的防腐保鲜、食品添加剂、饲料添加剂及化妆品中,具有良好的应用价值和市场前景。 国内外学者已就家蝇的免疫诱导防御反应分别在蛋白质水平和基因水平进行了研究。虽然关于家蝇的抗菌肽研究有报道,但主要是同源克隆家蝇的抗菌肽基因及其表达。从虫体内提取天然抗菌物质从上世纪80年代就已开始,但直到最近才见单一较纯的抗菌肽利用色谱技术被纯化出来的报道,对纯化的抗菌肽进行一级结构研究甚少。利用色谱技术分离纯化诱导家蝇蛹体内的抗菌肽,从诱导的家蝇蛹的粗提液中分离纯化出了4种抗菌物质,即3个抗菌肽和1个抗菌化合物。3个抗菌肽分别是分子量为11992.48Da的IA,家蝇defensin和分子量为7988.43Da的IIB。其中家蝇defensin是首个从家蝇体内分离纯化并鉴定出的家蝇抗菌肽。首次从诱导家蝇蛹中分离得到一个非肽/蛋白类抗菌活性成分,分子量为1051.67Da。 应用RT-PCR技术对4种抗菌肽/蛋白基因在家蝇蛹内的表达进行了研究,明确了家蝇蛹体内cecropin、defensin和attacin等抗菌肽的表达是诱导型的,而lysozyme是组成型表达。应用生物信息学的方法,证实了家蝇defensin具有典型的昆虫防御素空间构象,即αββ结构,家蝇lysozyme属于c-typelysozyme,具有家族的共同特征,如保守的8个Cys和两个活性催化位点及三个α-螺旋和三个β-折叠股。
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