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目前已公认的平滑肌收缩与舒张的主要调节机制是在Ca2+的参与下,由肌球蛋白轻链激酶(MLCK)催化的磷酸化肌球蛋白轻链(MLC20)与肌动蛋白的相互作用而产生收缩。但这一学说并不能全面解释平滑肌收缩的特点。在生理条件下,当细胞内[Ca2+]i降至静息水平后,某些部位的平滑肌特别是括约肌和血管平滑肌并未松弛,而是继续维持一定的张力。这种低Ca2+水平时平滑肌张力的持续状态可使器官对抗所加负荷而保持原有形状,具有重要生理意义。但这一现象的机制是传统的钙依赖性调节学说无法解释的,提示在平滑肌收缩过程中还存在着其它非Ca2+依赖性调节途径。本研究发现了MLCK的一个活性片段、痕量调宁蛋白及蛋白激酶A等均可以非钙依赖性方式调节肌球蛋白的功能,可能对低Ca2+水平时平滑肌张力的维持起一定的作用。这些发现不仅促进了平滑肌收缩的非钙依赖性调节机制的研究,而且为平滑肌系统疾病的治疗以及新药开发提示了新的途径,具有一定的理论意义和应用价值。<WP=6>第一部分 肌球蛋白轻链激酶活性片段对肌球蛋白轻链的非钙依赖性和钙依赖性磷酸化作用及作用特征肌球蛋白和MLCK均从新鲜鸡胃平滑肌组织中提取纯化;用Trypsin水解MLCK,经纯化后获得61KD MLCK活性片段(MLCKF);用Western blot检测并证实MLCKF与完整MLCK的同源性;利用基因重组大肠杆菌表达并提取钙调蛋白(CaM);将所得蛋白用于肌球蛋白轻链磷酸化反应,并以SDS-PAGE及Scoin Image密度扫描软件检测MLC20磷酸化的程度;用分光光度法测定肌球蛋白MgATP酶的活性。结果显示:⑴ 当无Ca2+/CaM存在时,61KD MLCK活性片段能使MLC20非钙依赖性磷酸化(CIPM);其催化的CIPM效力略强于MLCK催化的CIPM,但明显弱于MLCK催化的钙依赖性磷酸化(CDPM);与MLCK催化的CDPM相比,该片段介导的CIPM持续时间长,较稳定,不易受温育时间、温度及KCl 浓度等条件变化的影响,亦不易被ML-9抑制;⑵ 当有Ca2+/CaM存在时,61KD MLCKF能催化CDPM;当与MLCK的浓度、温育时间、温度及所加KCl 浓度都相同时,该片段催化CDPM的作用强于MLCK;⑶ 无论有无Ca2+/CaM存在,61KD MLCKF对肌球蛋白MgATPase都有明显激活作用;该片段在有Ca2+/CaM时对MgATPase的激活作用明显强于其本身及完整MLCK在无Ca2+/CaM时的作用。以上结果说明,61KD MLCK活性片段能以非钙依赖性和钙依赖性两种方式参与平滑肌收缩活动的调节;其催化的CIPM很可能对低Ca2+水平时平滑肌张力的维持起一定作用;同时,该片段还可能作为MLCK的一个辅助成分催化CDPM,参与启动平滑肌收缩。在相同浓度下,该片段的催化作用强于完整MLCK。第二部分 痕量调宁蛋白对肌球蛋白功能的非钙依赖性调节作用肌动蛋白从兔骨骼肌丙酮干粉中提取纯化;调宁蛋白(calponin)从新鲜鸡胃平滑肌组织中提取纯化;肌球蛋白、MLCK及CaM的提取<WP=7>纯化方法同前;分别将MLCK和PKA用于肌球蛋白轻链磷酸化反应;再将不同磷酸化状态的肌球蛋白和肌动蛋白用于蛋白结合实验,以检测它们与痕量调宁蛋白的结合能力;肌球蛋白MgATP酶活性的检测方法同前。结果显示:⑴ 在无肌动蛋白情况下,痕量调宁蛋白能显著增加未磷酸化肌球蛋白和MLCK磷酸化肌球蛋白的沉淀,并提高上述肌球蛋白的MgATPase活性,即使调宁蛋白与肌球蛋白的比率非常低(1/10000, mol/mol),说明调宁蛋白对肌球蛋白的作用效力是极高的;⑵ 痕量调宁蛋白不能增加PKA磷酸化的肌球蛋白沉淀,说明其与肌球蛋白的结合作用是有选择性的;但能提高PKA磷酸化肌球蛋白的MgATPase活性,说明痕量调宁蛋白对MgATPase的激活作用并不直接与其同肌球蛋白的结合能力相关;⑶ 在无肌球蛋白情况下,痕量调宁蛋白不能与肌动蛋白结合;当肌动蛋白与肌球蛋白同时存在时,痕量调宁蛋白对肌球蛋白和肌动蛋白的沉淀均无明显影响,亦不能改变肌动蛋白激活的肌球蛋白MgATPase活性,说明肌动蛋白能解除痕量调宁蛋白对肌球蛋白的调节作用,提示只有当肌动蛋白脱离肌球蛋白后,痕量调宁蛋白才能与肌球蛋白结合发挥高效能的调节作用。根据以上结果推测,当细胞内[Ca2+]i降至静息水平,肌球蛋白与肌动蛋白之间已无相互作用时,痕量调宁蛋白可与肌球蛋白结合发挥高效能的调节作用,轻度提高其MgATPase活性,使平滑肌维持一定的张力而不完全松弛。第三部分 蛋白激酶A对肌球蛋白功能的非钙依赖性调节作用蛋白提取方法同前;将PKA和ACAD用于肌球蛋白轻链磷酸化反应,并以前述方法检测MLC20磷酸化的程度;将不同磷酸化状态的肌球蛋白用于蛋白结合实验,以检测它们与痕量调宁蛋白的结合能力;用分光光度法测定肌球蛋白MgATP酶活性,检测PKA对MgATP酶活性的影响。结果显示:⑴ PKA在无Ca2+/CaM条件下能使肌球蛋白20KD轻链轻度磷酸化,当ACAD存在时该作用可明显增强;PKA介<WP=8>导的CIPM效力明显低于MLCK介导的CDPM和CIPM;⑵ PKA能轻度提高肌球蛋白MgATPase活性,该作用亦可被ACAD增强;PKA对MgATPase的最大激活作用与MLCK在无Ca2+/CaM时的最大激活作用基本相同,但明显低于MLCK在有Ca2+/CaM时的最大激活作用。⑶ PKA抑制了肌球蛋白与痕量调宁蛋白结合的能力,提示PKA与MLCK磷酸化的肌球蛋白构象可能有所不同,导致与痕量调宁蛋白结合的能力不同。根据以上结果推测,PKA在ACAD的