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目的:观察双调控并荷载精子相关抗原9(sperm associated antigen 9，SPAG9)短发卡RNA(Short hairpin RNA，shRNA)的溶瘤腺病毒联合化疗药物多西他赛(Docetaxel，DTX)体内外对激素抵抗性前列腺癌的治疗效果，并初步分析作用机制，为前列腺癌治疗提供新的思路。
方法:
1.将包含DD3基因启动子和SPAG9基因shRNA的载体质粒pDD3-ZD55-SPAG9shRNA与骨架质粒pBHGE3(含有腺病毒右臂序列)通过LipofectamineTM2000共转染至293细胞株内，包装成溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9，琼脂糖电泳验证正确后大量扩增病毒，通过CsCl密度梯度离心法纯化，半数组织细胞感染剂量(Tissue culture infective dose，TCID50)法测定滴度。
2.体外实验分六组，病毒联合化疗组(5感染复数(Multiplicityofinfection，MOI)DD3-ZD55-SPAG9+1ng/mlDTX)、病毒治疗组(10 MOI DD3-ZD55-SPAG9)、对照病毒治疗组(10 MOI ZD55-SPAG9)、对照病毒治疗组(10 MOI ZD55-EGFP)、化疗组(2 ng/ml DTX)、磷酸缓冲盐溶液(Phosphate-buffered saline，PBS)对照组。
3.结晶紫法观察各处理组对前列腺癌PC-3和DU-145细胞及人正常前列腺永生基质细胞WPMY-1的毒性作用。
4.细胞增殖检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)法检测各处理组对PC-3和DU-145细胞及WPMY-1的增殖抑制作用
5.划痕实验观察各处理组对PC-3和DU145细胞迁移能力的影响。
6.Transwell观察各处理组对PC-3和DU145细胞侵袭能力的影响。
7.Hoechst-33258染色观察各处理组对PC-3和DU145细胞凋亡的影响。
8.WesternBlot检测前列腺癌细胞内SPAG9蛋白;侵袭相关蛋白E-钙粘蛋白(E-cadherin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和基质金属蛋白酶2(Matrix metallo proteinase-2，MMP-2);凋亡相关蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)和caspase-8的表达情况，检测WPMY-1细胞中E1A的表达情况。
9.建立前列腺癌PC-3细胞荷瘤鼠模型，实验分为5组(每组5只小鼠):PBS对照组、DTX化疗组、ZD55-SPAG9对照病毒治疗组、DD3-ZD55-SPAG9病毒治疗组和DD3-ZD55-SPAG9+DTX病毒联合化疗组。
10.检测不同处理组对移植瘤的生长的影响。
11.苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining，HE)检测肿瘤的生长状况。
12.免疫组化法检测各组移植瘤细胞中的侵袭相关蛋白E-cadherin、Vimentin和MMP-2的表达情况。
13.原位末端缺口标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)法检测各组移植瘤细胞的凋亡情况。
14.WesternBlot检测移植瘤细胞内SPAG9，E-cadherin，Vimentin和MMP-2的表达。
15.使用单样本方差分析或studentT检验进行统计分析，以P＜0.05为具有统计学意义。
结果:
1.成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9，经扩增纯化后，DD3-ZD55-SPAG9与对照病毒ZD55-SPAG9和ZD55-EGFP的病毒滴度分别为9.46×1O^8pfu/ml;1.58×10^9pfu/ml;2.13×10^9pfu/ml。
2.结晶紫染色结果显示:DD3-ZD55-SPAG9组、ZD55-SPAG9组、ZD55-EGFP组对PC-3和DU145细胞的细胞毒性呈时间和滴度依赖性，DTX对PC-3和DU145细胞呈浓度和时间依赖性，各组处理48小时后，高浓度的DTX(＞4ng/ml)对WPMY-1产生毒性作用，高滴度的ZD55-EGFP,ZD55-SPAG9(MOI＞20)，DD3-ZD55-SPAG9(MOI＞50)对WPMY-1细胞产生毒性，提示DD3-ZD55-SPAG9较对照病毒具有更好的靶向治疗作用。
3.CCK-8结果显示:随病毒和药物作用时间的延长，前列腺癌细胞的存活率均逐渐降低，且随病毒滴度和药物浓度的升高，对细胞的毒性也逐渐增强，感染48小时后，病毒联合化疗组的细胞存活率明显低于DD3-ZD55-SPAG9、ZD55-SPAG9、ZD55-EGFP和DTX组，差别具有统计学意义(p＜0.05)。WPMY-1细胞处理48小时后存活率无明显差异，96小时后，在高滴度(MOI＞20)，DD3-ZD55-SPAG9联合组存活率明显高于ZD55-SPAG9组和ZD55-EGFP组。
4.划痕实验结果显示:在PC-3和DU145细胞内，联合组、DD3-ZD55-SPAG9组、ZD55-SPAG9组、ZD55-EGFP组、DTX组的划痕愈合面积百分比均低于PBS组，且联合组划痕愈合面积明显低于单一治疗组(P＜0.05)。
5.Transwell实验结果显示:在PC-3和DU145细胞内，联合组、DD3-ZD55-SPAG9组、ZD55-SPAG9组、ZD55-EGFP组、DTX组穿透小室膜的细胞数均低于PBS组，其中，联合组穿透细胞数明显低于单一治疗组(P＜0.05)。
6.Hoechst-33258染色结果显示PC-3和DU145细胞处理48小时后，联合组、DD3-ZD55-SPAG9组、ZD55-SPAG9组、ZD55-EGFP组、DTX组的细胞凋亡率均高于PBS组，且联合组细胞凋亡率明显高于其他治疗对照组(P＜0.05)。
7.WesternBlot实验结果显示:联合组、DD3-ZD55-SPAG9组、ZD55-SPAG9组、ZD55-EGFP组、DTX组SPAG9基因的蛋白表达均低于PBS组，侵袭相关蛋白E-cadherin的表达均高于PBS组，Vimentin的表达均低于PBS组，MMP-2的表达均低于PBS组，凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-8的表达均高于PBS组。其中，联合组SPAG9，Vimentin，MMP-2的表达量明显低于单治疗组(P＜0.05)，E-cadherin、caspase-3和caspase-8的表达量明显高于单治疗组(P＜0.05)。
8.成功构建荷瘤小鼠模型。
9.DD3-ZD55-SPAG9+DTX，DD3-ZD55-SPAG9，ZD55-SPAG9，DTX组的肿瘤体积均低于PBS组，且DD3-ZD55-SPAG9+DTX组肿瘤体积明显小于单治疗组(P＜0.05)。
10.HE染色显示PBS组内细胞排列极不规则，细胞内出现异性核和多核现象明显。各治疗组内出现细胞膜皱缩，细胞核固缩，碎裂明显多于PBS组，其中，DD3-ZD55-SPAG9+DTX与单治疗组相比，核固缩裂解现象更为明显。
11.免疫组化显示，各治疗组内，E-cadherin的表达均高于PBS组，Vimentin和MMP-2的表达均低于PBS组。各治疗组内，以DD3-ZD55-SPAG9+DTX组内E-cadherin表达量最多，Vimentin和MMP-2表达量最低(P＜0.05)。
12.TUNEL结果显示在各治疗组凋亡细胞的比例均高于PBS组，其中，以DD3-ZD55-SPAG9+DTX组细胞凋亡率最高(P＜0.05)。
13.WesternBlot结果显示:移植瘤细胞中，各治疗组内SPAG9蛋白表达均低于PBS组。DD3-ZD55-SPAG9联合DTX组与其它单治疗组相比，下降更为明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)。各治疗组与PBS组相比，E-cadherin表达均有上调，Vimentin和MMP-2的表达均有下调。DD3-ZD55-SPAG9联合DTX组对E-cadherin的上调作用，对Vimentin和MMP-2的下调作用较单治疗组更为明显，差别具有统计学意义(P＜0.05)。
14.以上差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
结论成功构建新型DD3-ZD55双调控溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9，体外实验证实，DD3-ZD55-SPAG9可以在肿瘤细胞内顺利增殖，其增殖效率和沉默SPAG9基因表达的效率略低于对照病毒ZD55-SPAG9，但DD3-ZD55-SPAG9的靶向安全性明显高于ZD55-SPAG9。DD3-ZD55-SPAG9在体外对激素抵抗性前列腺癌细胞系PC-3和DU145具有较好的诱导凋亡，抑制增殖和迁移侵袭能力的作用，其机制可能是沉默SPAG9基因表达后，通过调控与上皮细胞间质化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)进程相关蛋白，上调，E-eadherin，下调Vimentin，MMP-2的表达有关。联合多西他赛可起协同作用，增强DD3-ZD55-SPAG9的抗肿瘤效果。DD3-ZD55-SPAG9可有效抑制裸鼠移植瘤的生长，抑制肿瘤细胞上皮细胞间质化进程，诱导肿瘤内细胞凋亡。DD3-ZD55-SPAG9联合使用多西他赛可起到相互协同作用，其在体内抑制肿瘤的作用优于单独使用DD3-ZD55-SPAG9或多西他赛。为前列腺癌生物治疗提供实验依据。
方法:
1.将包含DD3基因启动子和SPAG9基因shRNA的载体质粒pDD3-ZD55-SPAG9shRNA与骨架质粒pBHGE3(含有腺病毒右臂序列)通过LipofectamineTM2000共转染至293细胞株内，包装成溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9，琼脂糖电泳验证正确后大量扩增病毒，通过CsCl密度梯度离心法纯化，半数组织细胞感染剂量(Tissue culture infective dose，TCID50)法测定滴度。
2.体外实验分六组，病毒联合化疗组(5感染复数(Multiplicityofinfection，MOI)DD3-ZD55-SPAG9+1ng/mlDTX)、病毒治疗组(10 MOI DD3-ZD55-SPAG9)、对照病毒治疗组(10 MOI ZD55-SPAG9)、对照病毒治疗组(10 MOI ZD55-EGFP)、化疗组(2 ng/ml DTX)、磷酸缓冲盐溶液(Phosphate-buffered saline，PBS)对照组。
3.结晶紫法观察各处理组对前列腺癌PC-3和DU-145细胞及人正常前列腺永生基质细胞WPMY-1的毒性作用。
4.细胞增殖检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)法检测各处理组对PC-3和DU-145细胞及WPMY-1的增殖抑制作用
5.划痕实验观察各处理组对PC-3和DU145细胞迁移能力的影响。
6.Transwell观察各处理组对PC-3和DU145细胞侵袭能力的影响。
7.Hoechst-33258染色观察各处理组对PC-3和DU145细胞凋亡的影响。
8.WesternBlot检测前列腺癌细胞内SPAG9蛋白;侵袭相关蛋白E-钙粘蛋白(E-cadherin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和基质金属蛋白酶2(Matrix metallo proteinase-2，MMP-2);凋亡相关蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)和caspase-8的表达情况，检测WPMY-1细胞中E1A的表达情况。
9.建立前列腺癌PC-3细胞荷瘤鼠模型，实验分为5组(每组5只小鼠):PBS对照组、DTX化疗组、ZD55-SPAG9对照病毒治疗组、DD3-ZD55-SPAG9病毒治疗组和DD3-ZD55-SPAG9+DTX病毒联合化疗组。
10.检测不同处理组对移植瘤的生长的影响。
11.苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining，HE)检测肿瘤的生长状况。
12.免疫组化法检测各组移植瘤细胞中的侵袭相关蛋白E-cadherin、Vimentin和MMP-2的表达情况。
13.原位末端缺口标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)法检测各组移植瘤细胞的凋亡情况。
14.WesternBlot检测移植瘤细胞内SPAG9，E-cadherin，Vimentin和MMP-2的表达。
15.使用单样本方差分析或studentT检验进行统计分析，以P＜0.05为具有统计学意义。
结果:
1.成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9，经扩增纯化后，DD3-ZD55-SPAG9与对照病毒ZD55-SPAG9和ZD55-EGFP的病毒滴度分别为9.46×1O^8pfu/ml;1.58×10^9pfu/ml;2.13×10^9pfu/ml。
2.结晶紫染色结果显示:DD3-ZD55-SPAG9组、ZD55-SPAG9组、ZD55-EGFP组对PC-3和DU145细胞的细胞毒性呈时间和滴度依赖性，DTX对PC-3和DU145细胞呈浓度和时间依赖性，各组处理48小时后，高浓度的DTX(＞4ng/ml)对WPMY-1产生毒性作用，高滴度的ZD55-EGFP,ZD55-SPAG9(MOI＞20)，DD3-ZD55-SPAG9(MOI＞50)对WPMY-1细胞产生毒性，提示DD3-ZD55-SPAG9较对照病毒具有更好的靶向治疗作用。
3.CCK-8结果显示:随病毒和药物作用时间的延长，前列腺癌细胞的存活率均逐渐降低，且随病毒滴度和药物浓度的升高，对细胞的毒性也逐渐增强，感染48小时后，病毒联合化疗组的细胞存活率明显低于DD3-ZD55-SPAG9、ZD55-SPAG9、ZD55-EGFP和DTX组，差别具有统计学意义(p＜0.05)。WPMY-1细胞处理48小时后存活率无明显差异，96小时后，在高滴度(MOI＞20)，DD3-ZD55-SPAG9联合组存活率明显高于ZD55-SPAG9组和ZD55-EGFP组。
4.划痕实验结果显示:在PC-3和DU145细胞内，联合组、DD3-ZD55-SPAG9组、ZD55-SPAG9组、ZD55-EGFP组、DTX组的划痕愈合面积百分比均低于PBS组，且联合组划痕愈合面积明显低于单一治疗组(P＜0.05)。
5.Transwell实验结果显示:在PC-3和DU145细胞内，联合组、DD3-ZD55-SPAG9组、ZD55-SPAG9组、ZD55-EGFP组、DTX组穿透小室膜的细胞数均低于PBS组，其中，联合组穿透细胞数明显低于单一治疗组(P＜0.05)。
6.Hoechst-33258染色结果显示PC-3和DU145细胞处理48小时后，联合组、DD3-ZD55-SPAG9组、ZD55-SPAG9组、ZD55-EGFP组、DTX组的细胞凋亡率均高于PBS组，且联合组细胞凋亡率明显高于其他治疗对照组(P＜0.05)。
7.WesternBlot实验结果显示:联合组、DD3-ZD55-SPAG9组、ZD55-SPAG9组、ZD55-EGFP组、DTX组SPAG9基因的蛋白表达均低于PBS组，侵袭相关蛋白E-cadherin的表达均高于PBS组，Vimentin的表达均低于PBS组，MMP-2的表达均低于PBS组，凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-8的表达均高于PBS组。其中，联合组SPAG9，Vimentin，MMP-2的表达量明显低于单治疗组(P＜0.05)，E-cadherin、caspase-3和caspase-8的表达量明显高于单治疗组(P＜0.05)。
8.成功构建荷瘤小鼠模型。
9.DD3-ZD55-SPAG9+DTX，DD3-ZD55-SPAG9，ZD55-SPAG9，DTX组的肿瘤体积均低于PBS组，且DD3-ZD55-SPAG9+DTX组肿瘤体积明显小于单治疗组(P＜0.05)。
10.HE染色显示PBS组内细胞排列极不规则，细胞内出现异性核和多核现象明显。各治疗组内出现细胞膜皱缩，细胞核固缩，碎裂明显多于PBS组，其中，DD3-ZD55-SPAG9+DTX与单治疗组相比，核固缩裂解现象更为明显。
11.免疫组化显示，各治疗组内，E-cadherin的表达均高于PBS组，Vimentin和MMP-2的表达均低于PBS组。各治疗组内，以DD3-ZD55-SPAG9+DTX组内E-cadherin表达量最多，Vimentin和MMP-2表达量最低(P＜0.05)。
12.TUNEL结果显示在各治疗组凋亡细胞的比例均高于PBS组，其中，以DD3-ZD55-SPAG9+DTX组细胞凋亡率最高(P＜0.05)。
13.WesternBlot结果显示:移植瘤细胞中，各治疗组内SPAG9蛋白表达均低于PBS组。DD3-ZD55-SPAG9联合DTX组与其它单治疗组相比，下降更为明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)。各治疗组与PBS组相比，E-cadherin表达均有上调，Vimentin和MMP-2的表达均有下调。DD3-ZD55-SPAG9联合DTX组对E-cadherin的上调作用，对Vimentin和MMP-2的下调作用较单治疗组更为明显，差别具有统计学意义(P＜0.05)。
14.以上差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
结论成功构建新型DD3-ZD55双调控溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9，体外实验证实，DD3-ZD55-SPAG9可以在肿瘤细胞内顺利增殖，其增殖效率和沉默SPAG9基因表达的效率略低于对照病毒ZD55-SPAG9，但DD3-ZD55-SPAG9的靶向安全性明显高于ZD55-SPAG9。DD3-ZD55-SPAG9在体外对激素抵抗性前列腺癌细胞系PC-3和DU145具有较好的诱导凋亡，抑制增殖和迁移侵袭能力的作用，其机制可能是沉默SPAG9基因表达后，通过调控与上皮细胞间质化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)进程相关蛋白，上调，E-eadherin，下调Vimentin，MMP-2的表达有关。联合多西他赛可起协同作用，增强DD3-ZD55-SPAG9的抗肿瘤效果。DD3-ZD55-SPAG9可有效抑制裸鼠移植瘤的生长，抑制肿瘤细胞上皮细胞间质化进程，诱导肿瘤内细胞凋亡。DD3-ZD55-SPAG9联合使用多西他赛可起到相互协同作用，其在体内抑制肿瘤的作用优于单独使用DD3-ZD55-SPAG9或多西他赛。为前列腺癌生物治疗提供实验依据。