基于线粒体DNA序列的鹿产品分子检测

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在我国,鹿产品大多为名贵中药材,且我国历代本草和现代药典均把梅花鹿或马鹿的产品列为正品。由于鹿产品价格昂贵,市场上屡见用伪劣产品来冒充名贵的鹿产品,因此对鹿产品进行质量检测非常有意义。目前,利用mtDNA序列检测鹿产品的方法大多为PCR-RFLP法、序列分析法和物种特异性PCR法,虽然这些方法能够有效地应用于鹿产品的检测,但是由于冒充鹿产品的动物源性成分较多,利用这些方法来检测鹿产品显得有些复杂且周期较长,因此有必要设计一套更加简单、快捷的方法。本文首先对抗凝血基因组DNA的提取方法进行了改进,并且对传统酚-氯仿法也做了修改。改进后的抗凝血基因组DNA提取法具有无毒、成本低、产率较高、操作简单、整个过程不到1 h等优点;修改后的酚-氯仿法更适合于微量鹿产品的基因组DNA提取。其次,利用GenBank数据库中鹿科动物线粒体全基因组序列,设计了可覆盖鹿科动物线粒体基因组序列的引物,利用这些引物对东北梅花鹿、东北马鹿和塔里木马鹿的线粒体进行了全基因组测序,并将注释完全的序列提交到GenBank数据库,同时对这些序列进行了分析,最后联合GenBank数据库中的鹿科动物线粒体全基因组序列,Clustal X 1.83软件序列比对后,利用MEGA 4.0软件对梅花鹿、马鹿和赤鹿进行了系统进化分析。结果表明:梅花鹿存在3个明显的支系,即中国种群(大陆和台湾)、日本南部种群和日本北部种群,且大陆梅花鹿与日本南部梅花鹿的亲缘关系更近,日本梅花鹿分化为南、北两个种群,至少通过两个大陆桥在晚更新世从亚洲大陆迁徙至日本,台湾梅花鹿可能已达到了种的水平;Cervus elaphus起源于中亚,向东、西两个方向分化,形成了两个不同的物种即马鹿(亚洲-北美种群)和赤鹿(欧洲种群),马鹿与梅花鹿的亲缘关系更近,塔里木马鹿是赤鹿的祖先;梅花鹿和马鹿有最近的共同祖先,与赤鹿的祖先在中亚地区分别向东、西两个方向迁徙进化,最终向东分化为梅花鹿和马鹿,向西分化为赤鹿。最后,利用本文测定的线粒体全基因组序列以及GenBank数据库中的鹿科动物、猪、牛、羊线粒体全基因组序列,采用Bioedit 7.0.9.0软件进行序列比对,根据种内具有保守性、种间具有特异性的原则选择合适的区域,利用Oligo 6.0软件设计物种特异性引物。结果设计出了梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿、驯鹿和牛特异性引物,并联合文献中的猪、羊、鸡特异性引物,建立了两套Multiplex PCR方法,能够从鹿科动物和常见家养动物两个方面对各类鹿产品进行检测,达到了稳定、可靠、周期短、成本低廉的效果;设计出了水鹿特异性引物,建立了水鹿特异性PCR方法,能够对水鹿进行特异性检测。
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