论文部分内容阅读
根据国内外研究及各国关于染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）技术在产前诊断中应用的指南，CMA技术是超声异常胎儿的首选检测方法，可提高染色体异常检出率6％~9%。但国内外对超声异常胎儿行CMA检测的指证尚不明确，且国内尚无关于各种超声异常胎儿与CMA阳性之间的大样本研究报道。 目的：本研究旨在探讨各种超声异常胎儿与CMA检测阳性率的相关性，从而为超声异常胎儿行CMA检测提供实验依据。 方法：回顾性分析1274例因胎儿超声异常行CMA检测及染色体核型分析的结果。并分析不同超声异常胎儿与染色体结果之间的相关性。 结果：(1)1274例超声异常胎儿的染色体微阵列分析检出染色体异常176例（13.81%），其中致病性染色体异常63例（4.95%），不明确致病性25例（1.96%）。其中1063例同时行核型分析检出异常核型98例（9.2%），aCGH较核型分析可提高染色体异常检出率14.2%。在结构畸形胎儿及非结构异常中分别可提高染色体异常检出率19.6%、11.1%。（2）超声结构畸形胎儿 aCGH检测阳性率14.7%。不同系统结构畸形胎中，胎儿颜面颈部畸形（24.66%）、心血管系统畸形（18.81%）及其他类畸形（19.23%）阳性率最高。常见胎儿结构畸形超声中，非孤立性结构畸形检测阳性率均＞10%，孤立性结构畸形中淋巴水囊瘤（43.75%）、十二指肠闭锁（34.78%）、Dandy-Walker综合征（20%）、唇腭裂（10%）检出染色体异常阳性率最高。肾缺如、异位肾、内脏反位胎儿未检出染色体异常。（3）607例非结构异常胎儿 aCGH检测检出12.9%染色体异常。软指标异常中，NT增厚（18.23%）、鼻骨发育不良（12.50%）、长骨短（11.11%）检出染色体异常阳性率最高，FGR阳性率2%、羊水过多阳性率14.29%，而肠管回声增强、脉络丛囊肿、羊水过少未发现阳性病例。 结论：结构畸形胎儿中，CMA阳性率14.7%，83%≥2个超声畸形阳性率大于20%。77%孤立性结构畸形中阳性率＜10%。非结构异常胎儿中，CMA阳性率12.9%，70%≥2个超声病例阳性率＞10%，54%孤立性非结构异常中阳性率＜10%，建议≥2个超声结构畸形或非结构畸形行 CMA检测。 第二部分基于孕母血浆中游离胎儿DNA的高通量测序技术在超声异常胎儿的染色体分析研究 染色体微阵列分析技术在产前领域应用广泛，目前用于产前CMA检测的胎儿样本来自于介入性手术，部分伴有穿刺禁忌症的孕妇无法接受检测。而基于高通量测序平台，利用胎儿游离DNA（cell free fetal DNA，cffDNA）的产前胎儿13/18/21三体基因筛查已广泛应用于临床，近年来已有利用cffDNA，基于高通量测序平台检测胎儿染色体微缺失或微重复的病例报道，但目前尚无大样本研究，评价所用方法的临床价值。 目的：本研究旨在探讨利用cffDNA，基于高通量测序平台，建立无创检测胎儿染色体微重复微缺失的方法及评价其在临床上的应用价值。 方法：（1）利用孕母外周血浆游离 DNA片段大小差异化分析法，分析1456例孕母外周血，建立可估算孕妇外周血中cffDNA浓度比例的模型，并通过测序计算 Y染色体的比例进行模型拟合度测试，建立可估计孕母外周血中cffDNA比例的方法；并检测1476例孕母血浆标本，评估临床上的应用价值；（2）利用22例已知致病性的染色体微重复微缺失 DNA与正常对照 DNA按比例混合，模拟cffDNA在母血浆中的状态，以不同异常 DNA浓度比例5%、10%、15%、20%、25%、30%在测序量为3.5M reads、5M reads、10M reads、15M reads条件下评估混合标本中染色体异常检出率，选择最优实验条件；（3）用新建立的无创方法检测1467例超声异常胎儿孕母外周血，其胎儿标本同时行 aCGH检测，将无创方法检测结果与 aCGH结果比较，统计分析灵敏度、特异度，评估该方法的应用价值。 结果：（1）孕母血浆游离 DNA中，140bp DNA代表胎儿，160bp DNA代表孕妇，建立了估算血浆中胎儿游离 DNA浓度的模型（拟合比例0.818）。检测1476例孕母血浆，其中88.5%胎儿 DNA浓度比例大于10%。（2）成功建立了基于高通量测序平台，利用cffDNA检测胎儿 CNVs的方法。检测混合样本时，3.5Mb reads时，可100%检出10Mb以上 CNVs，80%以上5Mb以上 CNVs。5Mb reads时，5M以上的片段可100%检出，而5M以下检测不出。10M reads及15M reads时，2M以上的片段可检出76%。（3）1476例孕母血浆标本，在3.5M reads时，可检出71.8%的染色体片段异常，检测5Mb以上片段的灵敏度98.15%，特异度97.84%，假阳性率2.16%，假阴性率1.85%。10M reads，检测1Mb以上染色体片段，灵敏度可至97.08%，特异度98.6%，假阳性率1.99%，假阴性率2.92%；检测中发现55例假阳性，其中29例来自于母亲携带，26例来源不明。 结论：提供了一种可估算胎儿游离 DNA浓度比例的方法，避免因浓度过低造成的假阴性结果。建立了基于 cffDNA的高通量测序检测胎儿染色体微重复微缺失的方法，在 cffDNA浓度比例＞10%时，3.5M reads推荐检测5Mb以上染色体微重复微缺失，10M reads推荐检测1Mb以上片段染色体微重复微缺失。