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我国苹果苗木繁育实践中,无性系矮化砧木生根能力普遍较差,成为制约矮化砧木和优质大苗繁育的重要瓶颈问题。开展不定根发生的分子调控机制研究,对苹果无性系砧木繁育技术的开发和分子育种具有重要意义。研究发现mi RNA在植物的生长发育过程中广泛发挥作用,课题组前期mi RNA组测序发现mi R393可能参与苹果砧木不定根发育调控。本研究以‘T337’苹果砧木的组培苗作为试验材料,采用生物信息学分析、RT-q PCR、转基因等技术,深入解析mi R393与其靶基因在苹果砧木不定根发生中的功能。主要研究结果如下:1.对mi R393家族进行系统进化分析和多重序列比对发现mi R393在不同物种间进化十分保守。克隆了苹果砧木‘T337’中的mdm-MIR393a和mdm-MIR393b,发现其序列与金冠基因组序列完全一致,mi R393家族不同成员的前体都具有稳定的茎-环结构,且启动子序列具有多个响应脱落酸、逆境和光信号的顺式作用元件。预测到苹果mi R393的靶基因共6个,其中mdm-mi R393a/b/c的3个靶基因属于生长素受体蛋白Md TIR1/AFBs家族的成员。利用RT-q PCR技术,发现苹果mi R393家族不同成员在苹果砧木‘T337’不同组织中表达模式相似;在苹果砧木‘T337’不定根发生过程中,mi R393能够响应外源生长素的诱导表达量发生改变,其中mdm-mi R393a/b/c在不定根发生关键时期表达量显著上调。2.利用拟南芥的同源基因在苹果中进行全组基因比对共获得12个Md TIR1/AFBs家族基因。对拟南芥和苹果的TIR1/AFBs家族基因构建系统进化树,可将其分为G1、G2和G3共3个亚组。通过对Md TIR1/AFBs家族的基因结构、保守基序、理化特性和启动子元件进行分析,发现Md TIR1/AFBs含有外显子数量介于1～14之间,内含子数量介于0～13之间;Md TIR1/AFBs蛋白的保守基序数量在3～10之间,理化特性分析发现Md TIR1/AFBs编码的蛋白氨基酸数量在222～1260 aa之间,等电点在5.40～9.22之间;Md TIR1/AFBs启动子包含激素、胁迫和光信号等顺式作用元件数18～44个。对关键成员Md TIR1A进行克隆,得到的编码区序列长度为1764 bp。组织特异性表达分析结果表明Md TIR1/AFBs家族的12个成员在不同组织中具有不同的表达模式。RT-q PCR结果显示Md TIR1A、Md TIR1D、Md AFB1、Md AFB2、Md AFB3、Md AFB4和Md AFB8可以响应外源生长素的诱导在不定根发生的关键时期表达量下调。3.农杆菌介导的烟草瞬时转化和降解组数据分析验证了mdm-mi R393b与Md TIR1A的靶向关系。外源生长素IBA处理可激活mdm-MIR393b启动子活性,相反生长素运输抑制剂NPA处理后明显受到抑制。在烟草中过表达mdm-MIR393b,烟草中靶基因Nt TIR1表达量降低,转基因烟草的不定根增长且数量减少,与野生型相比表现出对生长素的敏感性降低,说明苹果mdm-MIR393b可以靶向Md TIR1A,通过生长素信号响应在植物不定根发生中发挥作用。