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近年来,胃食管反流性疾病（gestroesophageal reflux disease,GERD）与支气管哮喘的关系一直是共同关注的焦点,随着有效的抑酸药物和便携式pH测试仪的出现,逐渐意识到胃食管反流（gestroesophageal reflux,GER）GER可能是哮喘的一个激发因素。为探讨GERD与哮喘的关系,合适的动物模型的建立是不可缺少的手段之一。目前认为GER性呼吸系统疾病的主要原因是食管-支气管反射和神经源性炎症,即由于盐酸刺激食管内的酸敏感受体促发迷走神经活动产生的,GER通过该反射引起气道高反应。在酸性胃食管反流状态下,由于食管-支气管反射,气道感觉神经受到刺激,一方面,通过轴突反射释放神经肽,引起神经源性炎症;另一方面,冲动传至中枢,与孤束核及相应节段脊髓背角的神经元形成突触,引起呼吸反射。研究发现该反射至少部分通过迷走神经介导,反射弧的感受器分布在气道上皮的感觉神经末梢,它们的胞体位于结状神经节和上段脊神经节（C7-T5）。P物质（substance P,SP）作为神经肽家族中最重要的成员,其发挥多种生物学效应是通过与其高亲和力受体NK-1的结合来完成的。研究显示,SP参与了哮喘和酸灌注食管的病理过程,但SP是否参与了胃食管反流性气道高反应的发病过程以及食管灌注盐酸豚鼠模型的C7-T5脊神经节和相应节段脊髓背角内的SP是否有变化目前尚不清楚。神经生长因子（nerve growth factor,NGF）是哮喘发病过程中的一个重要介质,支气管哮喘动物模型的研究结果显示NGF能引起气道高反应,但NGF是否参与GER性哮喘的发病机制目前尚不清楚。故以多次盐酸灌注豚鼠食管动物模型为研究对象,探讨SP在呼吸道和内脏传入部位的表达和NGF在肺组织中的表达。进一步研究食管-支气管反射及其相关的神经源性炎症的作用,试图为食管一支气管反射找出明确的解剖学证据。1、多次盐酸灌注豚鼠食管气道高反应动物模型的建立普通级健康雄性白化豚鼠30只,体重350g—450g,随机分为3组:A组:PBS对照组;B组:HCL模型组;C组:盐酸灌注+SR140333干预组。食管酸灌注法:盐酸氯胺酮注射液50g/L腹腔注射（1mL/kg）轻度麻醉豚鼠,仰卧固定于手术台,经口插5F胃管入食管的中、下段,以8滴/min速率缓慢灌注0.1mmol/L HCl（含0.5%胃蛋白酶）溶液,每次20min,每天一次,连续14d。对照组:用PBS代替盐酸灌注食管,方法同上。拮抗剂用法:将SR140333溶于1%DMSO的蒸馏水中,配成0.5mg/ml,按1mg/kg在每次灌酸前30分钟进行腹腔注射。2、气道反应性测定所有豚鼠于末次灌注后24h行气道反应性测定,戊巴比妥腹腔注射麻醉,将三组豚鼠应用AniRes2005实验动物肺功能检测分析系统（北京贝兰博科技有限公司）检测气道阻力。3、取支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALA）,BALF细胞成分计数;血管灌注,豚鼠处死,取豚鼠食管,气管,肺组织,C7-T5段脊髓和相应节段脊神经节。4、HE染色观察食管,气管和肺组织病理变化将豚鼠食管、气管和肺组织OCT包埋、切片后,进行HE染色,光镜下观察并照相。5、免疫组织化学染色检测SP和NGF的表达取对照组、实验组、干预组的气管、肺组织、C7-T5段脊髓和相应节段脊神经节切片,参照二步法免疫组织化学试剂盒步骤测定各部位SP和NGF的表达情况。6、RT-PCR检测肺组织、C7-T5段脊髓SP的表达,图像分析。7、免疫印迹检测肺组织中NGF的表达肺组织中蛋白提取和定量后,取等量样品进行聚丙烯凝胶电泳,经一抗和二抗孵育后显色,图像分析。8、统计学分析所有原始数据采用SPSS11.5统计软件进行数据分析。所有结果均表示为（?）±s,样本均数比较采用单因素方差分析方法,正态分布及方差齐时,两两比较采用LSD检验;非正态分布采用轶和检验,p＜0.05为差异有统计学意义实验结果1、三组豚鼠食管、气管和肺组织病理检测食管病理学HE染色显示,可见正常对照组豚鼠食管结构基本正常;模型组豚鼠食管上皮层不同程度增厚,以基底层及刺层细胞增生为主,上皮角化过度,乳头延长;固有层中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞浸润;粘膜下层内血管扩张,充血,符合轻度食管炎改变。支气管肺组织病理学HE染色显示,对照组豚鼠支气管肺组织结构基本正常;模型组气管可见纤毛柱状上皮明显增生,部分上皮脱落,粘膜和粘膜下层血管充血、扩张,腺体增生、肥大,杯状细胞增多,炎症细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润,肺组织、细支气管管壁及管腔内可见大量淋巴细胞及嗜酸性粒细胞浸润,细支气管管壁增厚,管腔狭窄,部分可见粘液栓。SR140333干预组模型的病理变化均较实验组有所减轻。2、气道反应性测定随着乙酰胆碱浓度的成倍递增,模型组与对照组的呼气阻力均有增加,当浓度到达25μg/kg体重以上时,模型组与对照组比较有显著差异（P＜0.01）。给予SR140333干预后,呼气阻力较实验组明显改善。3、BALF中白细胞计数及分类模型组BALF中细胞总数及嗜酸细胞百分比均高于对照组（P＜0.01）。给予SR140333干预后,与模型组比较明显减少。4、免疫组织化学染色及分析正常对照组、模型组和SR140333干预组支气管、肺组织、C7-T5段脊神经节和相应节段脊髓背角中均有SP的表达,但强弱不同,模型组明显高于其他两组（P＜0.01）。模型组下呼吸道NGF的表达明显高于正常对照组（P＜0.01）。5、RT-PCR检测SP的表达各组肺组织和C7-T5段脊髓背角中SP含量不同,模型组高于正常对照组、SR140333抗体组（P＜0.01）。6、免疫印迹检测NGF的表达模型组和对照组NGF蛋白含量不同,模型组高于对照组。结论1、成功建立了多次盐酸灌注豚鼠食管气道高反应动物模型,为进一步探讨GERD与哮喘的关系提供了帮助。2、SP在豚鼠下呼吸道、C7-T5段脊模型较对照组明显增加。提示胃食管反流性气道高反应存在气道神经源性炎症,并且神经源性炎症参与了胃食管反流性气道高反应的中枢神经的发病机制。3、NK-1受体拮抗剂可以降低多次盐酸灌注豚鼠食管气道高反应动物模型的气道阻力。NK-1受体拮抗剂可以下调多次盐酸灌注豚鼠食管气道高反应动物模型下呼吸道和内脏传入部位SP的表达,即阻断了其气道神经源性炎症。4、NGF在豚鼠下呼吸道有表达,NGF在GER性气道高反应豚鼠下呼吸道中表达明显,提示NGF可能参与了GER性哮喘的发病。