恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病之一,全世界每年被诊断为癌症的病人有1100万之多,预计到2020年每年新增病例将达到1600万。结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,近年来发病率呈上升趋势,严重威胁着人类的生命,其死亡率仅次于肺癌和肝癌,占我国恶性肿瘤发病率的第三位。目前对于结肠癌的治疗方法主要有手术疗法、化学及放射疗法。化学疗法和放射疗法对机体有较大的毒副作用,如：减弱机体的免疫力,病人在治疗后易感染等；虽然手术疗法对机体伤害较小,但治愈率低。因此,寻找高效无毒的抗肿瘤药物一直是肿瘤学家关注的焦点。目前从天然产物中已经获得许多具有抗肿瘤活性的蛋白,如：植物凝集素蛋白,核糖体失活蛋白等,研究表明,这些活性蛋白具有高效、低毒的抗肿瘤效应,因此是一类极具发展前景的肿瘤治疗药物。谷子(Setaria italica)属一年生禾本科属植物,起源于我国的黄河流域。米糠是谷子加工成小米的过程中得到的副产品。研究表明：米糠富含丰富的营养组分和有益于健康的功能分子,如：甘油三酯、脂蛋白、谷维醇、维生素B、维生素E、葡萄糖、纤维素以及微量元素等。有报道揭示米糠蛋白提取液具有抗氧化、抗真菌和抗高血糖等免疫调节功效。但国内外关于米糠抗肿瘤活性蛋白的研究尚属空白。本研究以纯天然小米米糠为原料,利用生物化学技术从米糠蛋白粗提液中获得了单一的抗肿瘤活性蛋白组分,命名为：FMBP；通过分子生物学技术和质谱技术对该蛋白的生物学特性进行了鉴定；在细胞水平和裸鼠成瘤模型中探讨了FMBP蛋白的抗肠癌效应。分别从氧化应激、细胞周期阻滞、细胞凋亡及细胞迁移等方面对其作用机制进行了探讨。主要研究内容及结果如下：(1)采用丙酮沉淀和硫酸铵沉淀法制备米糠粗蛋白,通过SP-阳离子交换层析、蛋白质的热稳定性结合体外抗肿瘤活性实验,纯化得到单一的蛋白组分FMBP,热稳定性实验结果表明：该蛋白分子结构非常稳定,具有较强的耐热性。经过SDS-PAGE电泳和MALDI-TOF-TOF-MS质谱分析,确定该蛋白的分子量为35.1531133 kD；经MALDI-TOF/MALDI-TOF/TOF质谱鉴定和基因序列分析,确定FMBP为一种分泌型过氧化物酶,且具有较强的过氧化物酶活性。(2)在细胞水平上采用MTT法,分析了FMBP对人结肠癌细胞株DLD1、SW480、HT29和人正常结肠上皮细胞株FHC增殖的影响。结果表明：FMBP能够抑制三种结肠癌细胞的增殖,且具有浓度和时间依赖性,而对正常结肠上皮细胞FHC无明显作用；随后发现FMBP通过下调c-Myc, cyclinD1和p-Rb的表达水平来诱导结肠癌DLD1的细胞周期在G0/G1期阻滞,导致其增殖抑制；分别采用Hochest染色法和Annexin/碘化丙啶双染法检测FMBP处理对DLD1和FHC细胞凋亡的影响。结果表明,FMBP处理后,DLD1的细胞核出现典型的凋亡小体,且当FMBP的浓度为0.1mg/ml时,DLD1细胞的凋亡率达到56.5%,而FHC细胞仅为9.5%。这些结果表明,FMBP能够靶向诱导结肠癌细胞凋亡。(3)采用DCFH-DA荧光探针标记法,检测FMBP处理对结肠癌细胞DLD1、 HCT116和正常细胞FHC内ROS水平的变化。结果表明,FMBP处理后,DLD1、 HCT116和FHC细胞内ROS含量均升高。当FMBP的浓度为0.1 mg/ml时,结肠癌细胞DLD1和HCT116内的ROS含量分别升高了10倍和6倍,而FHC细胞的增加幅度较小,仅升高了2倍。随后检测了FMBP处理对三种细胞抗氧化指标的影响。结果表明：结肠癌DLD1和HCT116细胞的CAT活性和GSH含量均下降,而FHC细胞无明显变化；用ROS抑制剂NAC和FMBP共处理以上三种细胞,发现FMBP诱导的以上效应均被显著逆转。(4)通过检测线粒体膜电位和caspases家族蛋白的表达量,进一步确定了FMBP诱导凋亡的分子机制。研究结果表明,经FMBP处理后,DLD1细胞的线粒体膜电位显著下降；Western blotting结果显示,caspase-8, caspase-9和caspase-3被显著激活,促凋亡蛋白Bax表达量上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达量下降。加入广谱caspase抑制剂z.-VAD-FAK后,这种效应被显著逆转,表明FMBP可通过caspase依赖的信号途径诱导细胞凋亡。(5)采用细胞划痕法检测了FMBP对DLDl和FHC细胞迁移的影响。结果表明：FMBP能够显著抑制结肠癌DLD1细胞的迁移,而对正常结肠上皮细胞FHC无影响。进一步研究表明,FMBP对肿瘤细胞迁移的抑制效应是通过抑制DLD1细胞发生上皮间质转化(EMT)实现的。研究结果提示：FMBP处理首先抑制JAK1/STAT3信号通路,导致STAT3下游靶基因c-Myc和Snail-1蛋白表达水平下降,EMT途径受阻。为了验证STAT3的关键作用,本研究构建了慢病毒重组质粒pLVXAcGFP1-N1-STAT3,建立了过表达STAT3的DLD1稳定株,发现STAT3过表达能够部分逆转FMBP诱导的抗迁移效应。(6)用结肠癌DLD1细胞建立了裸鼠皮下成瘤模型。通过腹腔注射的方法,定期进行给药处理(共6次)。结果显示,FMBP蛋白在裸鼠体内能够显著抑制结肠癌肿瘤的生长,而不影响裸鼠的正常生长。随后采用免疫组化的方法对肿瘤组织中与细胞增殖、凋亡和迁移的相关指标进行检测,包括：Ki-67、caspase-8, caspase-3, TUNEL、STAT3、p-STAT3、E-cadherin、Vimentin,其结果与细胞水平的实验结果相一致。综上所述：FMBP是一种分泌型的过氧化物酶,该蛋白在细胞水平和裸鼠体内均能发挥抗肠癌作用。以上研究结果表明,FMBP通过诱导肿瘤细胞内产生过量的ROS发挥其靶向抗肠癌效应；通过诱导结肠癌DLD1在细胞周期Go/G1期阻滞而抑制其细胞增殖；通过caspase介导的内源性和外源性凋亡途径诱导结肠癌细胞凋亡；通过拮抗STAT3介导的EMT通路来抑制结肠癌细胞转移。因此,FMBP可以作为一种潜在的抗肿瘤保健品和药物中间体进行深度开发。