多年以来,糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)及其并发症(酮酸尿毒症、大血管病变和微血管病变引起的脑卒中、失明等)一起严重地危害着人类的健康和生活水平,成为与心脏血管类疾病和癌症并列引起人类死亡的三大主要病因之一。目前的中国糖尿病患者总数已经超过了9200万,糖尿病前期患者为1.48亿,越居全球第一。胰岛素,作为一种目前临床最有效、最基础和最安全的糖尿病治疗药物,随着日益加剧的糖尿病患病率,其市场需求也在增加,而且在生物制药及其研究领域里呈现了广阔的发展和应用前景。从1922年首次临床成功应用胰岛素治疗糖尿病患者至今,从1921年早期动物胰脏提取的动物胰岛素到基因工程重组人胰岛素,胰岛素的应用与发展史历经了约90年。成熟的胰岛素由21个氨基酸的A链和30个氨基酸的B链组成,分子约5.7 kD。胰岛素A链和B链通过2个链间二硫键(A7-B7、A20-B19)和1个分子内二硫键(A6-A11)连接。随着分子生物学、蛋白质及其相关技术的发展,国内越来越多的胰岛素相关研究集中在了建立高效、简易、低廉且高纯度的重组人胰岛素的工业制备体系方面。本研究期望通过重组表达质粒的设计、表达系统与最佳发酵条件的选择和优化等提高设计所得重组人胰岛素的表达产量,同时建立实际可行的复性工艺,为后续下游的纯化、酶切、分离等工艺创造条件。实验中,我们选用pET-39b质粒载体、BL21大肠杆菌工程菌表达系统,B链C端设计合适长度的信号肽和6个组氨酸(His)构成的短肽,分别用于提高工程菌的表达量和利用金属离子镍柱简化蛋白纯化[1];A链和B链的C端分别通过两个精氨酸(Arg,R)连接合适长度的模拟短C肽,既不影响重组蛋白的重折叠复性又简化了后续的酶切、分离步骤,得到双链重组人胰岛素。结果表明我们在每升培养基中收获了大肠杆菌E.coli菌体840 mg (湿重),包涵体367.89 mg (湿重),表达水平达到43.8%,重组人胰岛素目标蛋白约占总蛋白量的25%。然后经过还原变性、复性得到了单链重组人胰岛素类似物——HI-270,通过Tricine-SDS-PAGE、HPLC(高效液相)等技术手段初步证明了目标蛋白的正确性。