血红素蛋白是一大类含有原卟啉Ⅸ（血红素，heme）作为辅基的金属蛋白，在生命体系中执行着重要的生物功能，如氧载体功能（血红蛋白，Hb和肌红蛋白，Mb），电子传递功能（细胞色素b₅，cyt b₅和细胞色素c，cyt c等），生物催化功能（细胞色素P450，cyt P450和细胞色素c过氧化物酶，CcP等），以及生物传感功能（CO传感器CooA和NO传感器sGC等）。相同的辅基heme如何被不同的蛋白分子所利用，来执行不同的生物功能，一直是化学生物学和蛋白质化学研究领域所关注的重点，人们正试图对这一问题进行解答来认识金属蛋白结构—性质—反应—功能之间所蕴含的精妙关系。Cyt b₅是血红素蛋白中电子传递蛋白的典型代表，其辅基heme与蛋白肽链的结合是以非共价键的方式进行的，结合能力主要来自heme轴向双组氨酸His39和His63的配位作用，以及氢键和疏水作用等。Cyt b₅与cyt c不同，后者辅基heme的两个乙烯基与蛋白肽链上结合heme的结构片段域Cys-Xaa-Xaa-Cys-His（CXXCH）中的半胱氨酸形成了两个硫醚键，因而以共价键的方式相互结合。同时，与cyt c或Mb相比，cyt b₅分子中辅基heme有着更大的溶液暴露程度。这些原因直接导致了cyt b₅具有较低的辅基结合稳定性。纵观cyt b₅的研究历程，我们发现关于cyt b₅轴向配体的研究相对较少，这主要是因为heme轴向配体的突变会很大程度上降低cyt b₅的辅基结合能力，以至于通过体内表达的方法得不到轴向突变体的全蛋白（holo-protein），只能表达出没有结合heme的脱辅基蛋白（apo-protein）。后者由于蛋白稳定性低，而且没有holo-protein的特征红色，给后续分离纯化带来了很大的困难，操作过程较提纯cyt b₅复杂得多，往往需要投入很多时间和精力，才能获得足够纯度的蛋白用于进一步实验研究。然而，关于血红素蛋白结构、性质和功能的很多研究，正是集中在活性中心辅基heme的轴向配体上。因此，如何提高cyt b₅辅基结合的稳定性，以及如何简化cyt b₅的分离纯化方法，特别是如何使用简便的提纯方法来获得cyt b₅轴向突变体的apo-protein，是一系列值得研究与探索的课题。由于cyt b₅中并不存在cyt c中所具有的结合heme的结构片段域CXXCH，而且整个蛋白肽链中并不存在Cys，因此无法形成类似cyt c中的硫醚键。通过对cyt b₅晶体结构信息作仔细深入地研究后，我们发现距离heme 2-乙烯基和4-乙烯基最近的氨基酸残基分别为Ser71和Asn57，它们的β位碳原子与2-、4-乙烯基α碳原子的距离分别为4.32和3.86（?）。这样的距离很适合共价键的形成，如果将这两个位点的氨基酸残基分别用Cys取代，在蛋白表达的过程中，所引入的Cys极有可能分别与heme的两个乙烯基发生加成反应，形成类似cyt c中的硫醚键。因此，我们运用定点突变的方法构建了cyt b₅，N57C、cyt b₅ S71C以及cyt b₅ N57C／S71C突变体，并对其进行了性质表征。研究证明，在cyt b₅分子中heme乙烯基附近适当的位置引入半胱氨酸，通过体内表达的方法，的确可以实现辅基heme与蛋白肽链的共价键合。所引入的Cys与heme分别形成了两种不同的Cysteine-Heme共价键：其中在57位形成了经典的硫醚键，而在71位形成了非典型的[heme-CO-CH₂-S-CH₂-C_α]键。这种差别主要取决于所引入半胱氨酸与heme乙烯基之间的距离，乙烯基自身的取向，以及各自所处的微环境等因素。研究结果也表明并不需要构建类似cyt c中所特有的结合heme的结构片段域CXXCH，即可实现cyt b₅向cyt c的结构转化，这说明CXXCH对于heme与蛋白肽链间的共价键合并非是必需的因素。而且，我们研究发现，具有heme共价键合的cyt b₅（cyt c-like cyt b₅）在去折叠状态下表现出相当高的过氧化酶催化活性。这些研究成果为我们认识c-型细胞色素的形成机理，以及认识血红素蛋白的结构—性质—反应—功能之间的关系，提供了重要的信息。在寻求分离纯化cyt b₅的简化方法过程中，我们尝试了用谷胱甘肽S-转移酶表达系统，将cyt b₅表达为GST-cyt b₅融合蛋白的方式进行分离纯化。实验结果证实，cyt b₅的确可以以融合蛋白的形式进行表达，而且可以在体内表达得到结合有辅基heme的holo-protein。GST-cyt b₅融合蛋白的表达体系具有其他cyt b₅表达体系无法比拟的优越性，其操作相对简单，只需经过一步GST亲和层析即可得到目标融合蛋白。同时，融合蛋白的性质表征表明：融合蛋白内GST与cyt b₅之间的蛋白—蛋白相互作用相对较弱，它们的相互融合并没有很大程度上改变彼此的整体结构与基本功能。一方面GST-cyt b₅融合蛋白有着与cyt b₅相类似的性质与功能，另一方面它又具有GST的亲和性，这使得融合蛋白具有双重功能与应用前景。然而，在表达GST-cyt b₅轴向突变体蛋白时，只能得到apo-protein，而且，GST对heme的高亲和性严重影响了GST-cyt b₅突变体蛋白apo-protein与heme的体外重组。因而，GST表达体系并不适合用来获得涉及cyt b₅轴向突变的突变体蛋白holo-protein。此外，我们还通过组氨酸标记表达体系，在cyt b₅分子的N-端引入（His）_6-tag，然后用Ni²⁺亲和柱对cyt b₅进行分离纯化。研究表明，（His）_{6-cyt b5}有着与cyt b₅相类似的光谱学、电化学以及化学稳定性，说明（His）_6-tag的引入对蛋白的结构、性质和功能没有明显地影响。同时，（His）_6-tag的引入不影响apo-protein与heme的体外重组。因此，这种方法更适用于cyt b₅轴向突变的突变体蛋白holo-protein的获得。通过这种方法，我们获得了（His）₍6-cyt 6j H39G单点突变体，以及轴向His39与Gly42进行序列上互换的双点突变体蛋白[（His）_6-cyt b₅ H39G／G42H]。对突变体蛋白表征的结果表明：当heme轴向配位的组氨酸由39位转移至42位，仍能形成heme的轴向配体，只是相对天然的His39来说，His42的配位能力较弱。这一研究表明cyt b₅分子的蛋白肽链具有一定的柔韧性，因此要在cyt b₅的heme疏水腔中构建类似天然过氧化物酶分子中所存在的远端组氨酸（distal histidine），困难远比在蛋白结构相对更加刚性的Mb分子中构建要大得多。这些研究成果进一步拓宽了我们对cyt b₅的结构—性质—反应—功能关系的认识。