布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌引起的一种人兽共患传染病。危害人畜健康并给畜牧业发展造成巨大损失。该病在世界范围内广泛流行,我国也是布病的高发国家,新疆、青海、西藏、内蒙古等地区尤为严重,有效的检疫是预防和控制布鲁氏菌病的重要手段,传统检测方法存在易发生交叉反应、操作繁琐、敏感性低等缺点,研究敏感、特异、快速、适合临床应用的检测方法已引起了国内外的高度重视,本实验建立的布鲁氏菌实时荧光定量PCR与血清快速诊断试纸检测方法,将会为基层布病检疫和防控提供技术支持。本实验所做的工作及主要成果如下：1.布鲁氏菌BP26蛋白的表达、纯化。将bp26基因克隆到pGM-T载体,进行酶切、PCR及测序鉴定后,构建重组质粒pET-28a-BP26,转化表达菌并诱导表达、纯化,Western-blot分析其免疫原性。结果表明正确构建了pGM-T-BP26,成功表达了BP26融合蛋白,SDS-PAGE检测表明获得了高表达量、高纯度的蛋白,并且布鲁氏菌阳性血清能特异性与BP26蛋白相结合,表明具有免疫原性,为后续的免疫学检测试验奠定了基础。2.建立基于布鲁氏菌BP26蛋白的血清快速检测胶体金免疫层析试纸条。以胶体金标SPA和布鲁氏菌BP26蛋白制备免疫层析试纸条,并对其特异性、敏感性、准确性和稳定性进行检测。结果试纸条检测布鲁氏菌阳性血清为两条线,检测其他细菌抗血清只有质控线显色,5-10min可观察结果,具有良好的特异性；采用该方法、琥红平板、试管凝集分别检测45份布鲁氏菌M5免疫的小鼠血清,阳性率分别为95.6%(43/45)、86.7%(39/45)和93.3%(42/45),试纸条与琥红平板的符合率为90.6%,与试管凝集的符合率为97.9%,试纸条可检出1：100倍稀释的羊阳性血清；1：128倍稀释的小鼠阳性血清,表明具有较好的敏感性；本试纸条在4℃可保存6个月,表明该检测方法具有较高的稳定性。3.利用二重实时荧光定量PCR技术建立鉴别诊断布鲁氏菌和结核杆菌的方法。筛选布鲁氏菌omp10、omp19、omp17、omp25、omp31和结核杆菌cfp10基因的最佳引物组合,建立二重实时定量PCR鉴别诊断方法,对该方法进行稳定性、特异性和敏感性试验,并对临床样品及模拟样品进行检测。经筛选布鲁氏菌的omp25基因与结核杆菌cfp10基因引物组合最佳,该二重实时荧光定量PCR方法中布鲁氏菌Tm值为88℃-89℃,结核杆菌Tm值为90℃-92℃,对其他供试的菌株则为阴性；该方法对布鲁氏菌的DNA最低检出量为20 copies/ul,结核杆菌为50 copies/ul,两病原都存在时为100copies/ul,比常规PCR高100倍。利用所建立的二重荧光定量PCR方法及常规PCR,对34份结核痰样、11份布鲁氏菌基因组DNA及30份模拟奶样进行检测,符合率为100%。结果证明本实验建立的方法可用于同时检测布鲁氏菌和结核杆菌,并且具有良好的特异性、敏感性和准确性。