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肌肉的生长发育一直是人们的研究重点,其过程中涉及了许多复杂交错的调控网络。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)可以通过多种因子在不同转录水平参与肌肉细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程。lncRNA H19可以通过H19/Igf2基因座与MyoD共同影响肌肉的生成,然而H19和MyoD二者之间的作用机制仍不清楚。本实验室利用山羊背最长肌和骨骼肌卫星细胞(Skeletal muscle satellite cell,SMSCs)为材料,成功扩增出H19基因全长,并检测了H19和MyoD在山羊不同时期不同组织的表达模式;采用过表达和抑制试验分析二者对SMSCs分化的影响;并利用双荧光素酶报告系统、染色质免疫共沉淀和荧光原位杂交、RNA稳定性试验对H19和MyoD之间的作用方式进行了初步验证。主要研究结果如下:(1)通过cDNA末端快速克隆(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)首次成功扩增出山羊H19基因全长,包含2个转录本。利用在线软件编码能力预测软件分析其不具备蛋白质编码潜能且在转录起始位点附近具有G-四联体结构。(2)表达模式结果表明,H19在背最长肌组织中表达量极显著高于其他组织(P<0.01),在不同时期的肌肉组织中H19胚胎期的表达量极显著高于出生后期(P<0.01)且在胚胎期120天达到峰值;在不同时期肌肉组织和SMSCs中,H19和MyoD表达量均为先上升后下降,尤其在细胞分化期二者表达量极显著高于增殖期(P<0.01)。(3)过表达H19,H19和MyoD以及分化标志基因Myomaker、Myomerger和MyoG表达量分别上升了4.0、2.1、4.9、2.5和2.0倍(P<0.01),而抑制H19的表达,这些基因的表达量分别下调了2.5、5.0、6.2、2.9和1.9倍(P<0.01)。此外,过表达和抑制MyoD的表达,H19和MyoG同样分别上调和下降了6.9、3.0倍和4.1、6.7倍(P<0.01)。H19和MyoD表达量的增加均可以促进SMSCs成肌分化过程,且二者之间表现出明显的正调控关系。(4)选用JASPAR和IntaRNA软件对H19和MyoD之间的结合位点进行预测,并根据结合位点的分布进行双荧光素酶报告系统和染色质免疫共沉淀试验进行验证,结果表明MyoD不但可以作为转录因子结合至H19启动子区域增强其活性,也可以结合至H19外显子区域增加其表达。(5)通过荧光原位杂交试验发现,H19和MyoD、MyoG和MEF2C在RNA水平上的位置关系十分接近且主要在定位在细胞质中。进一步RNA稳定性试验结果表明,H19可以通过改变MyoD mRNA稳定性影响其表达。综上,本研究首次扩增出山羊H19基因全长,初步验证H19与MyoD在转录水平和转录后水平均可以调控山羊骨骼肌细胞的分化。