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研究背景和目的血管增殖失调是临床常见的病理过程,如动脉粥样硬化、同种异体移植后血管重塑、支架内再狭窄、经皮球囊血管成形术等,探讨血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)的起源有助于增生性血管病的治疗。以往认为胚胎的VSMCs起源于神经嵴和胚胎中胚层;新近发现VSMCs还可能起源于成体骨髓干细胞或祖细胞、外周血的单核细胞、骨骼肌的成体干细胞和内皮细胞(Endothelium cells,ECs)等。Yamashita J等的体外研究证实,胚胎干细胞来源的胎肝激酶-1(Fetal liver kinase-1,Flk-1),即血管内皮生长因子受体-2阳性细胞在血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)作用下可分化为血管ECs,在血小板源性生长因子-BB作用下可分化为VSMCs,因此认为Flk-1阳性细胞是血管ECs和VSMCs的共同前体,然而该理论尚缺乏在体证据支持。我们通过对胚胎血管行Flk-1、血小板内皮细胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31)、Ⅷ因子相关抗原及平滑肌α-肌动蛋白(Smooth Muscleα-actin,SMα-actin)免疫组织化学染色,探讨上述标志物在血管形成初期的表达时相及空间位置关系,为VSMCs的起源提供新的在体实验依据。Flk-1主要分布于ECs、造血细胞及其前体细胞,已有报道Flk-1最早出现于小鼠胚胎6.5 d,在ECs及造血细胞的发育中发挥重要作用;在血管新生生理过程或肿瘤等病理过程中也可观察到Flk-1呈高表达,但小鼠植入前胚胎是否表达Flk-1迄今尚未见报道。本实验拟初步探讨Flk-1在小鼠植入前胚胎发育过程中的表达规律及其在胚胎发育中的作用。实验方法1.获取8.5～18.5 d胚胎:将母鼠分别放入公鼠笼内过夜、交配。次日清晨检查到白色阴道栓者为怀孕鼠,该天记为怀孕第0.5 d。在母鼠怀孕第8.5～18.5 d,处死母鼠,取出胚胎。2.获取植入前胚胎:母鼠腹腔内注射孕马激素10 U,44～48 h后注射人绒毛膜促性腺激素5 U,随后将其分别放入公鼠笼内过夜、交配。12 h获取单细胞期胚胎,36 h获取2细胞期胚胎,48 h获取4细胞期胚胎,60 h获取8细胞期胚胎,84～96 h获取囊胚。从超排卵母鼠的输卵管冲出单细胞期胚胎到8细胞期胚胎,从子宫中冲出桑椹胚和囊胚。3. 8.5～18.5 d胚胎标本置4%多聚甲醛(Paraformaldehyde,PFA)中室温固定3 h,按常规脱水后石蜡包埋,制备横断面5μm厚度连续切片,挑选胸腔部分和腹腔部分的主动脉切片染色。4.植入前胚胎经3 g/L聚乙烯基吡咯烷酮/磷酸盐缓冲液(Polyvinylpyrrolidone/ phosphatebuffered saline,PVP/PBS)中洗涤,2.5% PFA室温固定15 min,置PVP/PBS液4℃保存,待用。5. 8.5～18.5 d胚胎切片行苏木素-伊红染色,观察背主动脉形态学变化。6. 8.5～18.5 d胚胎切片行Flk-1、CD31、Ⅷ因子相关抗原及SMα-actin免疫组织化学染色,观察胚胎发育过程中,背主动脉ECs及VSMCs标记物的表达变化。7.收集植入前各期胚胎20个,采用mRNA Capture Kit试剂盒可捕获总mRNA,行Flk-1的反转录-聚合酶链(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)反应,观察Flk-1的表达变化规律。8.植入前各期胚胎采用微滴操作行Flk-1全胚免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察Flk-1的表达及定位。9.将8细胞期胚胎置于含5 mg/L Flk-1中和抗体的胚胎培养液中培养12 h后,加入绿色荧光标记的羊抗大鼠二抗,观察透明带是否能通过抗体等大分子物质。10.取8细胞期胚胎随机分3组,实验组加入Flk-1中和抗体5 mg/L至胚胎培养液中,空白对照组为胚胎培养液,抗体对照组加入非中和抗体5 mg/L至胚胎培养液中,培养36 h后计算囊胚形成率。采用X2检验对数据作统计学分析,P﹤0.05有统计学意义。11. 8细胞期胚胎采用微滴操作行VEGF全胚免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察VEGF的表达及定位。实验结果1.胚胎8.5 d在胸腔部分和腹腔部分均可见左、右背主动脉,9.5 d腹腔部分可见单一背主动脉,而胸腔部分心脏水平仍然维持左、右背主动脉的形态;8.5～9.5 d背主动脉呈现Flk-1阳性、CD31阳性、Ⅷ因子相关抗原阴性、SMα-actin阴性。2.胚胎10.5 d左、右背主动脉在腹腔部分和胸腔下部为一条背主动脉,但仍为单层细胞围成的管腔,而在心房水平仍然可见左、右背主动脉,且呈现SMα-actin、Flk-1、CD31、Ⅷ因子相关抗原均阳性。3.胚胎11.5 d背主动脉管壁发育为多层,内层细胞呈Flk-1阳性、SMα-actin阴性,外层细胞呈Flk-1阴性而SMα-actin阳性,血管与周围间充质无明显分界,背主动脉管壁周围可见散在SMα-actin阳性细胞。4.胚胎11.5 d之后,背主动脉管壁VSMCs数量增多且由不规则型转变为纺锤型,内层ECs继续呈Flk-1阳性、SMα-actin阴性,外层VSMCs Flk-1阴性、SMα-actin阳性,血管与周围间充质分界清楚,背主动脉血管周围无散在SMα-actin阳性细胞。5.在植入前小鼠胚胎中8细胞期胚胎Flk-1表达最高,在RT-PCR反应28个循环时只有8细胞期胚胎可检测到Flk-1;循环数增加到32个时4细胞期胚胎也检测到Flk-1表达。在单细胞期、2细胞期、桑椹胚期和囊胚期胚胎均未检测到Flk-1表达。6. 4细胞期胚胎的细胞膜上可见绿色荧光,主要定位于胚胎的外缘和细胞交界处,胞浆和胞核均未见绿色荧光;8细胞期胚胎细胞表面的绿色荧光较4细胞期胚胎增强,蛋白定位同4细胞期胚胎。单细胞期、2细胞期、桑椹胚期、囊胚期表达呈阴性。7.取8细胞期胚胎在含Flk-1中和抗体5 mg/L的胚胎培养液中培养12 h后加入二抗,发现绿色荧光出现在胚胎的透明带内部,说明透明带可通过抗体等大分子物质。8.取8细胞期胚胎在含Flk-1中和抗体5 mg/L的胚胎培养液中培养,各组36 h囊胚形成率如下:空白对照组80.95%(17/21),抗体对照组81.81%(18/22),实验组40.00%(10/25)。空白对照组和抗体对照组36 h囊胚形成率无统计学差异。实验组与空白对照组之间有统计学差异。但两实验组胚胎在48 h时仍可发育为囊胚。9. 8细胞期胚胎VEGF表达呈阳性,蛋白表达定位于胚胎细胞的胞浆内。结论1.胚胎背主动脉的VSMCs可能最早起源于Flk-1、CD31阳性细胞,后期可能来源于周围间充质细胞的募集分化。2.在小鼠植入前胚胎发育不同阶段Flk-1表达不尽相同,Flk-1的表达可能与促进植入前胚胎发育有关。