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目的:1.建立测定人血清中水溶性维生素B1、B2、B6和B9的高效液相色谱-质谱/质谱联用法并验证。2.比较高效液相色谱-质谱/质谱联用法和电化学分析法用于临床常规测定患者血清中维生素浓度结果的相关性与一致性。方法:1.齐鲁医院常规送检患者血清经乙酸乙酯萃取。色谱条件:VenusilXBP-C18色谱柱(150×4.6 mm,3 μm,100 A)。柱温30 ℃,流动相5 mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇(40:60,v/v),流速0.5mL/min。质谱条件:ESI离子源,正离子模式检测;干燥气温度为350℃,干燥气(N2)流速9.0L/min,干燥气压力40psi,毛细管电压4000 V,全扫描设定范围为m/z 150-700。维生素B1、B2、B6、B9和内标碎片电压分别为100V、140V、100V、110 V和130V,碰撞能分别为8 eV、25eV、11 eV、10eV和25eV。扫描方式为多反应监测(MRM)。维生素B1、B2、B6、B9和内标用于定量的母离子-子离子对分别为m/z 265→122.1、377→244、170→152、442.2→295.8、195.1 → 137.8。EMV 为 200V。采用液液萃取法萃取出血清中的维生素后,进行方法学的考察与验证。采用所建立方法,测定患者常规送检血清样本。2.电化学分析法:同一患者血清样本,按照规定程序操作,采用LK3000V维生素检测仪测定人血清维生素B1、B2、B6和B9的浓度。取适量的患者待测血清加入到样本处理液中,电极经过预处理后进行检测。维生素B9的检测需要电极处理后再按电极活化步骤进行电极活化。3.患者血清样本分别用高效液相色谱-质谱/质谱(HPLC-MS/MS)法和电化学分析法(LK3000V维生素检测仪)测定,测定结果进行统计分析。统计学处理采用SPSS 19软件和MedCalc 16.2.0软件。以HPLC-MS/MS法测定值作为自变量X,以电化学分析法(LK3000V维生素检测仪)测定值作为因变量Y,建立一元线性回归模型并评价相关性。运用Bland-Altman法并制图分析两种方法所测维生素B1、B2、B6和B9值的一致性。结果:1.维生素 B1、B2、B6、B9线性范围分别为 1-200ng/mL、5-40ng/mL、1-80 ng/mL 和 5-40 ng/mL;r2 值分别为 0.9916、0.9968、0.9922 和 0.9914;最低定量限分别为 1 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL,5 ng/mL;批内、批间 RSD 均小于 8.5%。维生素B1、B2、B6、B9、咖啡因(内标)基质效应分别71.82%、69.94%、70.91%、61.20%、81.42%;绝对回收率分别 29.01%、69.39%、63.22%、26.21%、63.79%。配制低、中,高浓度维生素B1、B2、B6和B9血清样本,室温放置6h、-20℃冷冻放置1天和7天及冻融1次和处理后血清样本室温放置20h,准确度为89.8%-107.7%,RSD小于10%。结果表明,维生素B1、B2、B6和B9稳定性良好。2.运用电化学法测定160份患者血清中维生素B1、B2、B6和B9的浓度结果。电化学法测得维生素B1、B2、B6和B9血清浓度均值分别21.44±5.26、6.50±0.80、12.36±3.54、5.59±1.49。3.采用统计软件处理HPLC-MS/MS法与电化学法测定数据。建立一元线性回归模型可得:B1:y=1.145x-2.741,n=160,决定系数 r2=0.965;B2:y=0.923x+1.091,n=160,决定系数 r2=0.956;B6:y=1.006x+0.391,n=160,决定系数 r2=0.901;B9:y=1.084x-2.241,n=160,决定系数 r2=0.978.由计算结果可见,HPLC-MS/MS 法测定值与电化学分析法测定值呈正相关关系,相关程度较高。运用Bland-Altman法并制图分析两种测定方法一致性,维生素B1、B2、B6和B9的95%一致性界限分别为-2.00～2.70,-0.29～1.00,-1.70～2.60,-2.12～-1.15 ng/mL。结果表明 HPLC-MS/MS法与电化学法测定人血清维生素B1、B2、B6和B9的测定值具有较好的一致性。结论:1.所建立的HPLC-MS/MS法灵敏度高,方法准确,结果可靠,可用于常规送检患者血清水溶性维生素B1、B2、B6和B9测定。2.电化学法测定人血清中水溶性维生素B1、B2、B6和B9,具有方便快捷,简便易操作,灵敏度高等优点,适用于临床血清中维生素浓度的常规测定。3.本研究建立了金标准HPLC-MS/MS测血清中水溶性维生素浓度的方法,并与电化学法进行相关性、一致性分析。HPLC-MS/MS法与电化学法测定人血清4种维生素的测定值具有显著相关性,并且一致性较好。提示电化学法用于水溶性维生素B1、B2、B6和B9临床常规检测的准确性和实用性。电化学法(LK3000V维生素检测仪)已常规用于临床检测患者血清中维生素的浓度。