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背景弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)在组织形态学、遗传学、免疫表型、临床表现、治疗反应及预后上均表现出明显的异质性。虽然约60%的患者通过一线标准免疫化疗达到完全治愈或长期生存,但是其余的患者多数因疾病复发难治死亡。尤其是治疗开始12个月内出现疾病早期进展(progression of disease within less than 12 months,POD 12)的患者,挽救性治疗联合自体造血干细胞移植也不能改善生存,通常预后更差。因此,有必要建立精准的POD12预测模型,探索超越标准一线治疗的替代方法,从而改善这些患者的预后。二代测序技术在DLBCL中的应用发现许多肿瘤驱动基因的异常,基于这些基因异常建立的分子预测模型初步研究显示较好的预测结果,也为探索DLBCL的新型治疗提供了思路。第一部分弥漫大B细胞淋巴瘤早期进展分子预测模型的研究目的整合DLBCL患者的临床、病理、细胞起源、分子和基因突变特征,建立新的POD12分子预测模型,为精准治疗提供依据。方法1.使用二代测序技术检测初治DLBCL患者肿瘤组织的55个热点驱动基因突变情况。2.收集和完善DLBCL患者的临床、病理、细胞起源、分子特征和生存资料。3.根据数据特征选择独立样本t检验、秩和检验或双侧χ2检验单因素分析基因突变、临床、病理、细胞起源、分子特征和POD12的关系;多因素分析应用logistic回归;OS和PFS预后分析应用Kaplan-Meier法;AUROC和拟合优度测试检验预测模型。结果1.研究共纳入84例DLBCL患者,94.05%的患者(79/84)发现热点驱动基因的突变,基因突变的中位频数为6(0-20)个;基因突变频率为0%～34.52%,突变频率超过1 0%的基因包括 IGLL5、TP53、PCLO、CD79B、PIM1、SOCS1、TNFAIP3、MYD88、BTG2、CCND3、KMT2D、IRF4、DTX1、CREBBP、PRDM1。2.POD12(n=28)和非POD12(n=56)患者基因突变频数没有统计学差异。基因突变频率比较发现,CD79B(p<0.001)和PIM1(p=0.006)突变在POD12患者中显著增加。临床、病理、细胞起源和分子特征与POD12的单因素分析显示性别、年龄、ECOG评分、Ann Arbor分期、LDH水平、结外累及数、IPI评分、细胞起源(Hans算法)、双表达和p53突变蛋白阳性均没有显示显著相关性。按照统计学设计,把 p<0.200 的 Ann Arbor 分期(p=0.081)、LDH(p=0.087)、双表达(p=0.161)、p53 突变蛋白阳性(p=0.111)和 CD79B 突变(p<0.001)、PIM1突变(p=0.006)共同纳入多因素分析,结果显示Ann Arbor分期(OR=4.367,p=0.025)、CD79B突变(OR=7.093,p=0.003)和PIM1突变(OR=6.377,p=0.011)与POD12独立相关。3.CD79B和PIM1突变患者显示出复杂的突变形式,17名CD79B突变患者中发生了 19个遗传事件,52.94%(9/17)患者出现ITAM结构域的Y196位点突变;16名PIM1突变患者中发现了 29个遗传改变事件,多发生在激酶区,无突出优势位点。CD79B突变未发现有统计学意义的伴随突变,PIM1突变与IRF4突变(6/16,p=0.002)伴随有统计学意义。CD79B突变与较差的PFS(p=0.000)和OS(p<0.001)相关,PIM1突变与较差的PFS(p=0.029)相关;CD79B和PIM1突变与临床、病理、细胞起源和分子特征没有明显的相关性。4.以Ann Arbor分期、CD79B和PIM1突变3个指标建立POD12预后预测模型,这三个变量分别被定义为1分。0、1、2和3分的患者中,POD12患者的比例分别为 10%(2/20)、26.09%(12/46)、73.33%(11/15)和 100%(3/3)。AUROC(0.765,95%CI:0.653-0.877)和拟合优度测试(Hosmer-Lemeshow 检验,χ2=0.403,p=0.940)证明这个POD12预测模型具有良好的性能,评分2-3的患者预测POD12敏感性50%、特异性92.6%,显著优于IPI评分(44.4%,p=0.356)、双表达(47.1%,p=0.161)、细胞起源(34.0%,p=0.898)、p53 突变蛋白阳性(53.8%,p=0.111)和 MCD(32.5%,p=0.856)对 POD12 的预测能力。POD12 评分 0、1、2、3 的患者 PFS(p<0.0001)和 OS(p=0.0002)存在显著性差异,呈负相关。在一组1001例患者的队列中这个POD12预测模型也被证实对OS具有显著的预测意义。结论由CD79B突变、PIM1突变和Ann Arbor分期组成的POD12预测模型能有效预测DLBCL早期复发,显著优于其它预后预测模型。第二部分基于新的POD12分子预测模型的新型治疗探索目的在新的POD12分子预测模型的基础上,初步探索超越标准一线治疗的新型治疗方法,改善患者预后。方法1.使用二代测序技术检测6个DLBCL细胞株中55个热点突变基因的突变情况。2.选择基因突变背景相似的细胞株,体外使用CCK8和流式细胞术检测靶向CD79B突变信号通路的BTK抑制剂伊布替尼和靶向PIM1突变信号通路的抑制剂的AZD1208对细胞增殖和凋亡的作用。免疫印迹技术检测伊布替尼和AZD1208对增殖和凋亡信号通路蛋白的影响。3.应用异种移植小鼠模型探索AZD1208抑制剂在有无PIM1突变异种移植瘤中的作用。结果1.二代测序技术检测发现伴随CD79B突变的Val细胞和PIM1突变的OCI-Ly8细胞具有相似的基因突变谱。2.选择1 0μM伊布替尼和40μM AZD1208分别对Val细胞和OCI-Ly8细胞进行了细胞增殖实验和凋亡实验,结果显示伊布替尼对CD79B突变Val细胞比CD79B野生OCI-Ly8细胞的抑制率和凋亡率更高,AZD1208对PIM1突变OCI-Ly8细胞比PIM1野生Val细胞的抑制率和凋亡率更高。异种移植小鼠模型显示AZD1208对于PIM1突变的OCI-Ly8移植瘤的生长抑制作用比PIM1野生Val移植瘤更强。3.伊布替尼和AZD1208介导的细胞凋亡率显著低于增殖抑制率。WB方法检测显示伊布替尼和AZD1208介导相关细胞增殖信号通路蛋白显著下降,但是没有下调抗凋亡蛋白BCL2的表达。4.尽管0.1μM BCL2抑制剂ABT-199单药诱导细胞凋亡有限,与10μM伊布替尼和40μM AZD1208联合对细胞凋亡表现出显著的协同作用。结论1.CD79B和PIM1突变可能分别是伊布替尼和AZD1208治疗DLBCL的敏感突变。2.联合BCL2抑制剂能够显著增加伊布替尼和AZD1208的凋亡作用。