食管癌(esophageal carcinoma, EC)是全球第八大恶性肿瘤,死亡率高,5年生存率不到15%。在我国,食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)是最常见的病理类型,具有易复发和转移等特点。对于早期病人,手术切除是主要的治疗手段；中晚期病人则以放化疗为主,但治疗效果并不理想。然而,因为缺乏典型的临床症状和有效的早期诊断技术,食管癌发现时往往已是中晚期,因此,寻找一种早期发现食管癌的方法显得尤为重要。从分子水平了解食管癌的发生发展机制,探索出有效的诊断及治疗靶点,对于食管癌的早期诊断及治疗具有深远意义。微小RNAs (miRNAs)是一类长约19-22个核苷酸的非编码RNA,通过连接靶基因的3’-UTR区域来发挥多重作用。目前已经在206种生物中发现了miRNAs,从微生物到动物均有涉及。miRBase官方网站上公布了2000多个miRNAs,预计超过60%的人类蛋白编码基因都会受到miRNAs的调控。miRNAs在调节细胞分化、增殖、侵袭、血管生成及细胞凋亡方面均发挥了重要作用。miRNAs的表达异常与恶性肿瘤密切相关,多种miRNAs参与食管癌的发生及发展过程,其中miR-183、miR-142、miR-483高表达,发挥了癌基因的作用,而miR-375、miR-98、miR-214、miR-143在食管癌中低表达,发挥了抑癌基因的作用。近年来大量研究表明,miR-373在多种恶性肿瘤中均发挥了重要作用。Voorhoeve等人于2006年第一次提出miR-373,作为一个新的癌基因,它在睾丸精原细胞瘤中通过阻断p53通路来参与肿瘤的进展。它也可以通过作用于靶基因PPP6C调节细胞周期,来促进肝癌细胞的生长。而在乳腺癌中,通过监测循环血中miR-373的表达含量可以了解是否发生淋巴结转移。另外,miR-373通过作用于Rab22a来抑制人卵巢癌的侵袭和转移,从而发挥了抑癌基因的作用。基因芯片技术分析,miR-373在ESCC组织中表达上调,比正常组织至少高1.5倍。然而,miR-373在ESCC中的作用机制目前尚不清楚,尤其在血浆中的表达水平及意义目前尚无研究。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)是一系列能够降解细胞外基质的蛋白水解酶,通过破坏瘤细胞周围的组织学屏障,促进恶性肿瘤细胞的浸润及转移。MMPs与基质金属蛋白酶抑制齐(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMPs)在正常人体内环境中处于平衡状态,由于肿瘤的特性,使两者之间的平衡被打破,从而提高了肿瘤侵袭及转移的能力。其中基质金属蛋白酶抑制剂-3(tissue inhibitor of metalloproteinase-3, TIMP3)与恶性肿瘤的关系密切,作为一种抑癌基因,TIMP3的低表达可以促进肿瘤的生长、侵袭和转移,还能抑制细胞凋亡。另外,通过检测TIMP3在膀胱癌及ESCC中的表达水平,还可以推测患者的预后。在以往的研究中,发现TIMP3与ESCC的迁移及侵袭能力密切相关,而通过生物信息学软件的预测,我们也发现TIMP3可能为miR-373的靶基因。在本项研究中,我们检测了miR-373在ESCC组织及血浆中的表达水平,并通过细胞转染技术使miR-373的表达上调或下调,观察miR-373对ESCC细胞增殖、凋亡、细胞迁移及侵袭能力的影响。寻找miR-373的直接靶基因,探讨miR-373在ESCC发病过程中的作用机制,为ESCC的诊断及治疗提供了新的理论依据。第一部分miR-373在食管鳞状细胞癌中的表达水平及临床意义目的：测定miR-373在ESCC组织及术前血浆中的表达水平,分析miR-373的异常表达与ESCC的分化程度、T分期、淋巴结转移及TNM分期等临床特征的关系,探讨miR-373在组织及血浆中表达水平的相关性。方法：从2012年10月到2014年9月在山东省肿瘤医院及泰安市中心医院首次诊断为ESCC患者中选取63名,收集肿瘤组织、瘤旁正常组织及术前外周血,另取39例健康志愿者的外周血作为阴性对照组。采用实时荧光定量PCR技术测定miR-373在ESCC肿瘤组织及瘤旁正常组织中的表达水平,同时检测了miR-373在术前ESCC患者及健康志愿者血浆中的表达水平。结果：1.miR-373在63例ESCC肿瘤组织中的表达水平要显著高于瘤旁正常组织(P<0.01)。miR-373在组织中的表达水平与分化程度、肿瘤T分期及淋巴结转移密切相关(P<0.05)。2. miR-373在63例ESCC术前血浆中的表达水平要显著高于39例健康志愿者(P<0.01)。miR-373在血浆中的表达水平与肿瘤T分期及淋巴结转移密切相关(P<0.05)。3. Spearman相关性检验分析得知,miR-373在肿瘤组织中的表达水平与血浆中的表达水平呈正相关(r=0.553,P<0.01)。说明miR-373在组织及血浆中的表达水平具有一致性。结论：miR-373在ESCC组织及外周血浆中的表达均显著升高,表明miR-373作为癌基因在ESCC的发病过程中发挥了重要作用。第二部分miR-373对食管鳞癌细胞株生物学行为的影响目的：观察miR-373表达水平的变化对ESCC细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力等生物学行为的影响,探讨miR-373的表达与ESCC生物学特性的关系。方法：实时荧光定量PCR技术检测4种ESCC细胞系中miR-373的表达水平。选取miR-373表达水平最高的KYSE410和表达水平最低的ECA109来进行功能实验。将miR-373 mimics转染到ECA109细胞中来提高miR-373的表达水平,将miR-373 inhibitor转染到KYSE410细胞中来降低miR-373的表达水平。通过CCK-8实验来评估ESCC细胞的增殖能力,凋亡检测试剂盒测定细胞凋亡的变化,应用未覆盖及覆盖Matrigel胶的Transwell小室分别来进行细胞迁移及侵袭实验。结果：1.miR-373表达水平的次序为KYSE410> EC9706> TE-1> ECA109。选取miR-373表达水平最高的KYSE410和表达水平最低的ECA109来进行功能实验。2.在ECA109细胞中,转染48h后,miR-373 mimics组的细胞增殖能力要高于阴性对照组(P<0.05)；而转染72h后,两者之间的区别更加明显(P<0.01)。在KYSE410细胞中,转染48h后,miR-373 inhibitor组的细胞增殖能力低于阴性对照组(P<0.05)；转染72h后,两者之间的差异仍具有统计学意义(P<0.05)。这些结果显示,miR-373可以提高ESCC细胞的增殖能力。3. miR-373 mimics组凋亡细胞所占的比例与阴性对照组相比,无显著区别(P>0.05)。而miR-373 inhibitor组凋亡细胞的比例要高于阴性对照组(P<0.01)。因此,抑制miR-373的表达可以促进ESCC的细胞凋亡。4.转染miR-373 mimics后ECA109的迁移能力及侵袭能力较阴性对照组显著提高(P<0.01)。转染miR-373 inhibitor后KYSE410的迁移能力及侵袭能力较阴性对照组显著减弱(P<0.01)。说明miR-373可以提高ESCC细胞的迁移及侵袭能力。结论：miR-373的过表达可以提高ESCC的细胞增殖、迁移及侵袭能力。抑制miR-373的表达可以减弱ESCC的细胞增殖、迁移及侵袭能力,促进肿瘤细胞的凋亡。第三部分miR-373对食管鳞状细胞癌作用机制的初步研究目的：miRNAs虽然不编码蛋白质,但是可以通过碱基互补配对的方式与mRNA的3’-UTR区域结合,导致mRNA的降解或抑制其转录后翻译。通过生物信息学软件,我们预测到miR-373存在多个潜在靶基因,结合在ESCC中与侵袭、转移有关的基因,我们选择TIMP3来进行下一步的研究,探索TIMP3是否为miR-373的直接靶基因来影响ESCC细胞的生物学行为。方法：检测转染前后ESCC细胞中TIMP3蛋白表达的差异,双荧光素酶实验验证TIMP3是否为niR-373的直接靶基因,同时通过功能实验进一步验证TIMP3是否影响miR-373对ESCC细胞的迁移及侵袭作用。结果：1.转染miR-373 mimics后, ECA109细胞中TIMP3蛋白的相对表达量要显著低于阴性对照组。转染miR-373 inhibitor后,KYSE410细胞中TIMP3蛋白的相对表达量要显著高于阴性对照组。2.双荧光素酶实验显示,TIMP3-3’UTR-WT与miR-373 mimics共转染到人HEK293T细胞中,其荧光值比阴性对照组下降37%,而TMP3-WT/NC, TIMP3-Mut/NC及TIMP3-Mut/miR-373之间没有显著差异。3.无3’-UTR区域的pcDNA3.1-TIMP3和miR-373 mimics共转染到ECA109细胞中。pcDNA3.1-TIMP3能够减弱miR-373 mimics对ECA109迁移及侵袭能力的促进作用。shRNA-TIMP3与miR-373 inhibitor共转染到KYSE410细胞中,shRNA-TMP3可以减弱niR-373 inhibitor对KYSE410迁移及侵袭能力的抑制作用。结论：在ESCC中,TIMP3为miR-373的直接靶基因,miR-373通过抑制TIMP3的表达来提高肿瘤的迁移及侵袭能力。