论文部分内容阅读
由于光学显微镜可以无损的对生物样品进行实时观测成像，是生物学家不可缺少的工具，而光学显微镜的发展也伴随着生命科学的进步。而由于光学衍射极限使得光学显微镜的分辨率被限制在200nm左右，阻碍了生物学家们进行更精细的研究。最近二十年超分辨显微镜的出现则打破了光学衍射极限的限制，为生物学家们提供了有力的研究工具。在本论文中提出了几种基于非线性效应的超分辨技术的方法，旨在提供更高的成像分辨率和更简单的超分辨成像方法。主要成果如下: (1)在一台商业化的激光扫描共聚焦显微镜的基础上搭建出一台受激发射损耗(STED)超分辨显微镜。我们利用STED对100nm的黄绿色荧光小球、细胞微管以及DNA折纸结构进行了成像，成像结果表明STED显微镜的分辨率优于100nm。在Hela细胞里分别标记溶酶体上的Lamp1蛋白和网格蛋白，然后使用激光共聚焦模式和STED模式对其进行成像。成像结果表明STED的分辨率和对比度都要优于激光共聚焦显微镜，搭建的STED系统可以应用于细胞样品。 (2)提出一种基于荧光共振能量转移(FRET)的STED成像方法。利用这种方法，即使在荧光峰发射距离STED的损耗光波长很远的情况下，STED依然可以有效地提升分辨率。我们首先建立了理论模型，然后又用Alexa405和atto488作为FRET对探针在实验上对理论进行了验证。 (3)提出了利用时间门来提升FRET显微镜的分辨率的超分辨成像方法。在FRET对中由于受体饱和而引起在不同激发光强条件下供体的荧光寿命不同。利用时间门技术可以将这里的光子发射时间信息来编码光子的空间信息，从而提升显微镜的分辨率。通过这种时间门FRET显微术，可以提升FRET显微镜的三维空间分辨率。另外，考虑到STED损耗光也可以改变荧光分子的激发态荧光寿命，我们将一束损耗光施加在受体上来调制受体的激发态寿命，从而进一步调制供体的激发态寿命。模拟结果表明施加了STED损耗光之后显微镜的分辨率得到明显的提升。理论上，即使STED的损耗光强是有限的，也可以通过设置门限时间来得到无限高的分辨率。 (4)首次提出了一种基于nanobody和荧光蛋白的高效率的FRET系统。通过nanobody作为中介将荧光蛋白和有机荧光染料连接构成FRET系统。由于nanobody的体积较小使得供体和受体之间距离只有2nm，因而可以产生高效的FRET过程。我们在荧光分光光度计和激光共聚焦显微镜上验证了这个概念并测得nanobody FRET系统的FRET效率可以达到97％以上。我们通过将nanobody标记在纳米金刚石以及细胞微管上验证了此FRET体系。此外，通过在各种细胞器和胞内蛋白以及各种荧光蛋白上进行了测试，实验结果表明了此FRET体系具有良好的普适性。这种高效FRET探针可以用于那些基于高效的FRET超分辨显微技术。 (5)提出了一种基于荧光漂白的超分辨成像方法。利用这种方法可以在普通的激光扫描共聚焦显微镜上实现超分辨成像而无需借助昂贵的超分辨显微镜。首先我们详细的介绍了荧光漂白超分辨技术的理论原理，并使用MATLAB进行理论模拟。在此理论基础上我们进行了一系列的实验在实验上验证了荧光漂白超分辨技术。我们测试了几种不同的荧光染料标记荧光小球，取得了～60nm的分辨率，相比于普通显微镜提高了3-4倍。接着我们对细胞微管进行漂白成像，获得了～100nm的成像分辨率。我们同时使用Alexa405和atto488去标记荧光小球以及细胞微管，然后使用不同的激发光进行双色荧光漂白超分辨成像。实验结果表明这种方法可以同时实现双色超分辨成像。