自噬是指膜(大部分表现为双层膜,有时多层或单层)包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体(autophagosome),最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autophagolysosome),降解其所包裹的内容物,以实现细胞稳态和细胞器的更新。目前普遍认为自噬是一种防御和应激调控机制,它为细胞的重建、再生和修复提供必须原料,实现细胞物质的再循环和再利用。自噬基因(autophagy-related gene,atg)的克隆始于酵母(yeast)。Atgl 蛋白(autophagy-related-gene-1)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是细胞自噬过程中非常关键的自噬相关蛋白之一。在自噬起始阶段时,Atg1-Atg13复合物可募集其他Atg蛋白,诱导细胞自噬的发生。鳞翅目昆虫Atg1对细胞自噬的调控作用尚不清楚,Atg1互作蛋白也研究较少。自噬相关蛋白Atg8是一种类泛素化蛋白,对自噬囊膜的延伸扩展起到重要作用,既参与底物的募集,又介导自噬小体与溶酶体的融合。它常被作为是研究细胞自噬的标记物。斜纹夜蛾Spodoptera litura(Fabricius)属于夜蛾科海灰翅夜蛾属,是一种多食性害虫,对许多农作物造成了严重的危害。本研究对已知的鳞翅目Atg1基因序列进行同源比对,根据基因片段的保守序列设计兼并引物,通过半巢式PCR方法扩增得到了 Atg1基因开放阅读框(ORF),并对此基因进行了生物信息学分析。将Atg1基因截短,分别构建Atg1-N末端600bp和Atg1-C末端500bp原核表达载体,将两种表达载体转化大肠杆菌BL21表达菌株,诱导表达并纯化截短的Atg1蛋白,用获得的纯化蛋白制备抗Atg1鼠抗和兔抗。然后,构建 Atg1 真核表达载体 pEGFP-N1-ie2-Atg1 和 pEGFP-N1-ie2-Atg1-Flag,转染S1-HP昆虫细胞,探究Atg1蛋白的表达与定位。接着将Atg1与其他自噬基因Atg8、Atg6、Atg5真核表达载体共转染S1-HP细胞,分别检测两者之间是否共定位。分别用饥饿和自噬抑制剂处理斜纹夜蛾S1-HP细胞,研究了二者对Atg1蛋白降解的影响。接着研究了 S1-HP细胞中Atg1的超表达和基因表达沉默对细胞自噬的影响。最后采用Co-IP技术探究了 Atg1与其它自噬相关蛋白的相互作用。实验结果表明,斜纹夜蛾Atg1开放阅读框全长2286bp,编码761个氨基酸,预测的分子量大小为82.6 kDa,等电点约为9.5。具有三个功能结构域,分别是激酶结构域、LIR结构域和Atg13结合结构域。在大肠杆菌中表达的全长蛋白容易降解,但是截短的蛋白比较稳定,可用于制备抗体。GFP-Atg1(或Atg1-GFP)融合蛋白分布于细胞质中,在细胞核内没有分布。它与Atg8,Atg6和Atg5部分共定位。饥饿诱导自噬导致细胞中Atg1因为降解而减少,抑制细胞自噬,可以导致Atg1积累,表明Atg1可以通过自噬溶酶体而降解。Atg1的超表达,加快了 Atg8-PE的降解;Atg1的表达沉默使Atg8-PE积累,表明Atg1促进细胞的自噬活动。免疫共沉淀技术表明Atg1可能与其它Atg蛋白存在相互作用。这些结果为揭示SlAtg1对自噬的多重调节及其分子机理提供了重要的基础。