本论文研究工作为国家自然科学基金资助项目—“归芎系列方功效变化的相关机理研究”的部分实验内容。论文共分为六章,第一章系统地综述了中药量效关系、药物相互作用的研究思路与方法,以及佛手散的化学与药理研究进展。第二章到第六章为实验部分,具体研究内容和相关结论如下:第二章归芎药对的样品制备第一节不同醇浓度的佛手散提取液样品制备按佛手散中当归与川芎的比例(3:2)称取药材,共1.5kg,用含有不同乙醇浓度(0%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、70%、95%)的8倍量醇水进行热回流提取两次,每次2 h,自然冷却后,倾出乙醇水溶液,过滤药渣,合并提取液进行真空减压浓缩干燥得到制备样品10个。第二节养血活血量效关系与相互作用研究用的样品制备按一定比例(0:1、1:5、2:5、2:3、1:1、3:2、5:2、5:1、1:0)称取酒当归和川芎,混合,共500 g,用8倍量的水进行热回流提取2 h,自然冷却后,倾出水溶液,再加入相同量的水进行再次热回流提取2 h,过滤,药渣再用95%乙醇进行热回流提取2 h,自然冷却后,倾出乙醇水溶液,过滤药渣,与水提液合并进行真空减压浓缩,干燥至浸膏,得制备样品9个。第三节抗氧化量效关系与相互作用研究用的样品制备基于响应曲面分析药物相互作用要求,对当归-川芎(归芎)设置不同配比(1:0、1:0.176、1:0.364、1:0.577、1:0.839、1:1.192、1:1.732、1:2.747、1:5.67、0:1),药材饮片按比例混合后进行热回流水提取(模拟水煎)、热回流50%乙醇水溶液提取(模拟酒煮)和先水提再95%醇提(模拟散剂),提取液进行减压浓缩并干燥后得到各制备样品30个。第三章归芎药对养血补血效应量效关系与相互作用研究第一节血虚模型探索联合应用乙酰苯肼和环磷酰胺,给予不同的造模剂量,复制小鼠及大鼠血虚模型,通过测定外周血常规、胸腺指数和脾脏指数、红细胞膜ATP酶活力变化等指标观察复方阿胶浆和佛手散对血虚小鼠及大鼠的补血作用。结果表明,与正常组相比,模型均造模成功,给予佛手散后,模型5有较好的恢复作用。选择模型5(于实验第1、4天皮下注射APH生理盐水溶液,剂量分别为10mg.kg-1,20 mg·kg-1,第4、5、6、7天腹腔注射CTX,剂量均为20 mg·kg-1)作为量效关系与相互作用研究用血虚模型。第二节佛手散不同醇提液补血作用比较研究应用乙酰苯肼与环磷酰胺复合法复制血虚小鼠模型。造模前后称体重,解剖分离胸腺、脾脏、肝脏,各脏器称重,计算脏器指数,检测模型动物外周血常规,用比色法测肝匀浆中总抗氧化能力(T-AOC),黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,并用权重系数法将以上指标转化为单指标,以发现不同醇浓度提取佛手散的总补血效应变化规律。结果显示,不同醇浓度提取的佛手散对各项指标均有不同程度的影响。各给药组对血虚造成的WBC数,RBC数、PLT、HCT指标降低有升高作用,具有统计学意义,给药后能纠正造模引起的体重下降及增加脾脏及胸腺免疫器官的重量,降低肝脏肿胀程度,能提高肝脏T-AOC以及SOD活性,总补血效应值大小顺序为:40%>30%>20%>15%>50%>10%>70%>5%>95%>0%。说明佛手散对血虚小鼠有补血作用,其中40%醇浓度提取佛手散效果更优。第三节基于药物相互作用对当归-川芎配伍养血补血效应研究采用乙酰苯肼与环磷酰胺致小鼠血虚模型,给予不同配比(0:1、1:5、2:5、2:3、1:1、3:2、5:2、5:1、1:0)不同浓度归芎药对后,观察其对外周血常规、脏器指数的影响,采用多指标综合指数法对各指标进行整合,然后运用响应曲面分析法对整合结果进行分析,应用非线性回归的方法确定量效曲线的各个参数,建立三维响应曲面模型,应用Matlab软件构建响应曲面的三维图形。结果发现,在整个三维响应曲面中,表现出协同作用的区域明显较大,其次是相加作用,未见明显的拮抗作用区域。当归与川芎的比例从4:1到2:1之间,从小剂量到大剂量,均表现为相加作用。而其他比例,则表现出小剂量为相加,大剂量表现为协同作用。第四节基于代谢组学的佛手散养血效应机制研究采用乙酰苯肼和环磷酰胺复合法复制小鼠血虚模型,将小鼠分为模型组、正常组、佛手散给药组,运用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)技术,对各组小鼠血浆中内源性代谢物进行测定,采用偏最小二乘-判别分析法(PLS-DA)、正交偏最小二乘-判别分析法(OPLS-DA)分析不同组小鼠血浆中的差异性代谢物,寻找潜在代谢标记物,发掘相关代谢通路。结果显示,模式识别中模型组小鼠能较好地与其他2组分开;进一步从模型组小鼠血浆代谢图谱中定性鉴定出半胱氨酸、柠檬酸、花生四烯酸、黄嘌呤、葡萄糖、白三烯B4、龙胆酸、左旋多巴等23种潜在代谢生物标志物,这些内源性物质在佛手散组小鼠体内得到了不同程度的恢复,通过独特通路分析,找到了花生四烯酸代谢、硫胺代谢、组氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、鞘脂类代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、乙醛酸和二羧酸根阴离子代谢、色氨酸代谢、糖酵解或糖异生、氮代谢、柠檬酸循环等多条血虚证代谢通路。第四章归芎药对活血祛瘀量效关系、相互作用研究与相关机制探讨第一节基于响应曲面分析法对归芎药对活血效应相互作用研究采用冰水浴与注射盐酸肾上腺素复制大鼠急性血瘀模型,给予不同配比(0:1、1:5、2:5、2:3、1:1、3:2、5:2、5:1、1:0)不同浓度归芎药对后,观察其对血液流变学各指标的影响,采用多指标综合指数法对各指标进行整合,然后运用响应曲面分析法对整合结果进行分析,应用非线性回归的方法确定量效曲线的各个参数,建立三维响应曲面模型,应用Matlab软件构建响应曲面的三维图形。结果发现,归芎药对配比在2:1到1.3:1之间,表现出明显的协同作用(协同作用强度为:-0.9);当归剂量从2-3.5 g、川芎剂量从7-9 g这个区域内,表现出拮抗作用(拮抗作用强度为:0.2);而其他比例并未表现出明显的协同或者拮抗作用。第二节佛手散活血祛瘀效应量效关系研究采用急性血瘀大鼠模型,给予佛手散提取物(0.25倍、0.5倍、0.75倍、1倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍临床等效量),测定全血黏度、血浆黏度、血沉、血压积、全血高切还原粘度和全血低切还原粘度等指标,采用权重系数法将所有指标整合为总活血效应值,以评价佛手散的总活血化瘀效应。结果显示,与正常组相比,模型组中各指标,均有显著性差异,提示造模成功。与模型组相比,给予佛手散后,能降低造模引起的血液流变学各指标数值。采用权重系数法处理后,活血效应的大小顺序为:0.25倍<0.5倍<0.75倍<10倍<8倍<1倍<2倍<4倍<6倍。表明佛手散对急性血瘀模型大鼠有明显改善作用,其中6倍临床等效量效果最优,0.25倍效果最差,呈现出明显的量效关系。第三节基于代谢组学的佛手散活血效应机制研究采用急性血瘀大鼠模型,将大鼠分为模型组、正常组、佛手散给药组,运用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)技术,对各组大鼠尿液中内源性代谢物进行分离鉴定,采用偏最小二乘-判别分析法(PLS-DA)、正交偏最小二乘-判别分析法(OPLS-DA)分析不同组大鼠尿液中的差异性代谢物,寻找潜在代谢标记物,发掘相关代谢通路。结果显示,模式识别中模型组大鼠能较好地与其他2组分开。与正常组大鼠相比,模型组大鼠尿液中的L-色氨酸、山梨醇、琥珀酸、肌酸、氨基己二酸、精胺的含量升高,色胺、苯丙酮酸、氨基已二酸半醛、苯乙酸、二氢鞘氨醇的含量降低,提示尿液中这11种内源性物质为血瘀大鼠尿液的潜在生物标志物。这些内源性物质在给药组大鼠体内得到了不同程度的恢复。通过代谢通路分析,找到3条血瘀证代谢通路,分别是苯基丙氨酸代谢、色氨酸代谢、鞘脂类代谢通路。第五章基于大鼠血虚兼血瘀证动物模型的佛手散养血活血效应评价采用环磷酰胺与乙酰苯肼联合复制血虚血瘀大鼠模型,给予佛手散后,通过测定血常规中各指标、红细胞膜Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、胸腺指数、脾脏指数、肝脏指数,观察佛手散对血虚血瘀证大鼠的补血作用;通过测定全血黏度、血浆黏度、血沉和血压积,观察归芎配伍对血瘀大鼠血液流变学的影响,考察其活血作用;通过测定凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和血浆纤维蛋白原(FIB)含量,观察归芎配伍对血瘀大鼠凝血功能的影响。结果显示,与正常组相比,模型组中各指标,均有显著性差异。与模型组相比,给予佛手散后,能使血常规中白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、平均红细胞体积(MCV)、平均血红蛋白含量(MCH)、红细胞分布宽度(RDW)、血小板计数(PLT)、血小板分布宽度(PDW)恢复到正常值;能降低血流变中全血低切粘度(1 S-1)、血浆粘度、全血高切还原粘度、全血低切还原粘度;对凝血四项中APTT、FIB、TT时间有显著延长作用;能使红细胞膜中Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP能量代谢酶上升;能使萎缩的胸腺恢复到接近正常组。说明佛手散能明显改善血虚血瘀大鼠的血常规、红细胞膜能量代谢酶、脏器指数、血液流变学及凝血功能异常。第六章当归-川芎药对不同制法与配比抗氧化活性相互作用研究采用2,2-二苯基-1-苦肼基(DPPH)自由基清除率法测定当归-川芎10个配比,3种不同提取方法的提取物的抗氧化活性,应用非线性回归的方法确定量效曲线的各个参数,建立三维响应面模型,应用Matlab软件构建响应曲面的三维图形。结果:不同配比不同制法的30个样品,均具有明显的清除自由基活性,且表现出明显的量效关系。水提液的协同作用范围窄,几乎成点状分布,拮抗作用范围呈6条宽窄不一的条带状分布;醇提液的协同作用呈小条状分布,拮抗作用呈点状分布。在先水提后醇提液协同作用呈条状分布(3条),拮抗作用呈点状分布。总之先水提后醇提液的协同作用区域大于醇提液,水提液次之;三种提取方法大部分区域均未表现出明显协同与拮抗作用。采用响应曲面分析法定量研究中药配伍药物相互作用,为相关研究提供了思路与方法的参考。结论:本论文通过建立养血活血效应评价体系,采用多指标综合指数法进行效应整合,采用响应曲面分析法定量评价了当归-川芎配伍相互作用,发现归芎药对随量比与制法不同其相互作用的性质与程度明显不同,并且都表现出明显的量效关系。比较来看,归芎配伍补血效应的协同作用范围大于活血效应,抗氧化作用协同范围最小,说明当归-川芎配伍后,整体功效偏向于养血补血。本论文还采用代谢组学研究思路,从血虚模型小鼠血浆、急性血瘀模型大鼠尿液中,找到归芎配伍给药后相关代谢通路,为揭示归芎药对组成规律及其科学内涵奠定基础。本论文的特色和创新点:1.采用多指标综合指数法对反映中医功效的各个药效指标进行标化与整合,从而获得适宜于比较评价的整合效应。2.采用响应曲面分析法设计与研究当归-川芎配伍相互作用的性质与程度,为中药配伍现代研究提供了思路与方法参考。3.基于代谢组学研究思路探究归芎配伍的效应机制,为最终揭示其组成规律奠定基础。